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摘要研究背景：<br>　　原发性肝癌(primary liver cancer,PLC)是长期危害我国居民生命健康的恶性肿瘤，85％以上的原发性肝癌患者为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC),其发病率在我国排第四位，死亡率达第二位，巨块型肝癌则是肿瘤直径超过10厘米的特殊肝癌类型。因这种类型的肝癌直径大，且存在肿瘤的获得性免疫耐受效应，导致其具有药物反应率低、术后复发率高以及易出现早期进展的特点。在肿瘤免疫治疗蓬勃发展的今天，肝癌患者的生存时间和生活质量均获得了较大提升。因此，尽管目前手术切除仍然是此类患者首选根治性治疗手段，但传统的直接切除手术所带来的预后，已经不能完全满足患者的期盼。所以，此类患者在手术切除的基础上寻找合适的降期或新辅助治疗手段，在降低肿瘤负荷的同时，提升机体抗肿瘤免疫能力，以形成新的优势治疗模式就显得尤为重要。<br>　　于此同时，明胶海绵材料微粒为栓塞剂的肝动脉化疗栓塞术(Gelatin sponge microparticles transcatheter arterial chemoembolization,GSMs-TACE)是一项已被证实可以有效控制中晚期肝癌的技术，该技术在血管数字减影平台的引导下，通过在肿瘤供血动脉内直接输注负载化疗药物的微粒，直接杀灭肿瘤。我们推测，随着肿瘤的杀灭，后续会存在肿瘤特异性抗原释放，继而免疫细胞在肿瘤微环境内发生趋化和增殖，最终完全改变肿瘤免疫微环境的过程。尽管前期研究已证明这种治疗手段具有机体外周血免疫效应能力提升的潜力，但是对于以微粒肝动脉栓塞术为代表的血管内局部治疗是如何改变肿瘤微环境并通过何种生物学机制改变全身外周血免疫细胞比例这一问题，目前尚缺乏文献报道。因此，本文将从肿瘤微环境内细胞构成、单细胞行为和空间转录组的角度阐述GSMs-TACE对肿瘤微环境的重建;并从外周血内肿瘤免疫相关淋巴细胞亚群的变化、免疫检查点占比变化以及患者无进展生存期的关系角度，阐述该治疗对预防巨块型肝癌早期复发的临床作用。<br>　　研究方法：<br>　　1.设计临床研究“GSMs-TACE联合手术切除治疗巨块型肝癌的一项单中心、回顾性对照研究”并完成伦理审查、临床研究注册和患者入组等步骤。取得来自于此研究的“直接切除的巨块型肝癌”全层肿瘤病理标本和各个时间点血样作为对照组;取得“GSMs-TACE治疗后一月再接受切除的巨块型肝癌”的全层肿瘤病理标本和各个时间点血样作为对照组作为实验组。<br>　　2.采用多重荧光免疫组化(Multiplex immunohistochemistry,mIHC)技术对两组标本进行处理。对mIHC切片进行图像信息提取和单细胞位置网络的构建，通过对各个亚群细胞密度、“细胞-细胞”等互作深度分析，阐述两组间微环境各个细胞分布和细胞行为异同。<br>　　3.采用空间转录组(Digital Spatial Profiler,DSP),于 mIHC 切片标定两组病理切片特殊的感兴趣目标区域(region of interest,ROI)后，进行带有空间信息的全转录扩增和测序，探究两组切片在整体上和“肿瘤中心”、“肿瘤边缘免疫浸润带”等不同类型区域内肿瘤细胞、浸润免疫细胞的转录组表达差异，再采用生信分析技术，着重分析对免疫细胞富集、趋化和行为阐述影响的趋化因子谱的差异基因，阐述造成GSMs-TACE后微环境的主要通路机制。<br>　　4.收集30例健康志愿者及30例接受任何抗肿瘤治疗的患者术前外周血样本，进行多标流式细胞检测，对包括免疫细胞各种亚群和免疫检查点表达在内的24个检测项目进行聚类降维分析，建立外周血“免疫正常化模型”。<br>　　5.根据外周血“免疫正常化模型”，评估30例患者在接受GSMs-TACE后，是否体现“免疫正常化”。同时以无进展生存时间作为主要研究终点,评估以“免疫正常化模型”作为分组条件，评估该模型对患者预后的预测价值。<br>　　研究结果：<br>　　1.对实验组和对照组各5例患者，总计10个巨块型肝癌手术后样本进行mIHC检测。发现巨块型肝癌GSMs-TACE后一个月，肿瘤抗原释放、免疫细胞招募完成后了不同于对照组的全新肿瘤微环境，并简述此微环境具有许多独特表现。<br>　　2.对实验组和对照组各5例mIHC切片的总计100个ROI进行图像信息提取及数字细胞网络建立后，对二者细胞密度、细胞-细胞互作深度分析显示，接受GSMs-TACE后再切除的标本中，肿瘤微环境内免疫效应性T细胞(effector Tcell,Teff)密度较对照组增高，且调节性T细胞(regulatory Tcell,Treg)较对照组降低，且以上现象在肿瘤边缘的“免疫浸润带”区域，更为明显。实验组微环境中每个Treg为中心，以30μm作用半径的区域内，效应T细胞数量较对照组增多;以单个Treg为起点，到最近一个CD8的距离也实验组为近，代表实验组标本Treg竞争性抑制Teff的效应强度得到了降低。另外。对照组标本在肿瘤边缘区体现出效应性免疫细胞密度中等而Treg密度较高的获得性免疫耐受现象;而接受了 GSMs-TACE的实验组标本在肿瘤边缘区域则出现了效应性免疫细胞较丰富而Treg密度中等的改变。以上结果体现出GSMs-TACE手术对肿瘤边缘的适应性免疫耐受区域的破坏作用尤其强烈。<br>　　3.对实验组和对照组各5例mIHC切片100个ROI进行DSP试验，发现GSMs-TACE干预后巨块型肝癌患者的肿瘤微环境与对照组相比，在转录组层面上存在的大量基因差异突变。涉及到细胞外基质、类固醇代谢通路、白细胞介素-4白细胞介素-13通路等多条机制。而其中CCL17为代表的趋化因子的表达谱相较于未经过干预的肝癌标本的明显差异，则为免疫浸润细胞的密度和行为改变找到了合理机制。<br>　　4.对30例接受GSMs-TACE治疗的巨块型肝癌患者治疗前、治疗后血样和30例健康志愿者血样分别进行流式细胞检测。显示GSMs-TACE治疗后1个月患者的Treg淋巴细胞的占比降低，辅助T细胞(helper T cell,TH)、自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)的淋巴细胞占提升，多数免疫检查点高表达细胞占相应细胞总数的比例下降，但相关变化没有统计学意义。综合以上各种细胞亚群比例数据，对总计24个维度进行降维后聚类分析，建立“免疫正常化模型”，再按此模型评估患者在接受GSMs-TACE治疗后1个月外周血免疫状态，发现多数患者实现免疫状态与健康人群聚成一类的“免疫正常化”状态。患者外周血标本在治疗后能否达到本研究模型“正常化”与微环境内多个关键免疫细胞的的转录组和免疫检查点的编码基因均有一定相关性。且按外周血“免疫正常化模型”分组患者，可以在一定程度上预测肿瘤进展时间。<br>　　研究结论：<br>　　1.GSMs-TACE治疗通过CCL17等信号通道的干预，实现巨块型肝癌患者肿瘤免疫微环境重建。使微环境中部分免疫细胞亚群的密度和细胞行为改变，并着重破坏巨块型肝癌边缘的肿瘤适应性免疫耐受区域，使微环境向更活跃的免疫效应方向发生改变。<br>　　2.GSMs-TACE通过对肿瘤免疫微环境重构，使患者外周血的免疫细胞构成更加接近健康人群。这个改变最终通过增强机体对肿瘤的免疫监控并提升其他联合治疗药物疗效，使得GSM-TACE得以在肝癌多学科诊疗模式中发挥长效作用，改善患者的远期预后。