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摘要研究背景:<br>　　世界范围内，肺癌的发病率在人类癌症中已位居首位，同时肺癌也是恶性肿瘤相关死亡的首要病因。近年来，我国肺癌发病率不断增加，在女性恶性肿瘤中仅次于乳腺癌,排名第二位，而在男性癌症中已位居首位。肺癌主要分为两大病理类型，即小细胞肺癌与非小细胞肺癌(Non-smallcelllungcancer,NSCLC),其中NSCLC约占肺癌确诊病例的85％,主要包括肺腺癌(Lungadenocarcinoma,LUAD)、肺鳞癌与肺大细胞癌。LUAD是最主要的NSCLC。现阶段，肺癌的治疗方式主要包括微创手术切除、辅助性化学治疗、靶向治疗与免疫治疗。随着测序技术的发展与肺癌相关驱动基因研究的不断深入，ALK基因融合、BRAF突变、KRAS突变、EGFR突变等分子分型已经应用到肺癌患者临床标本检测，并以此指导患者的靶向治疗，但是约50％的NSCLC患者在接受靶向药物治疗过程中产生耐药。此外，现阶段的肺癌免疫治疗主要是以PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂药物为主，包括帕博利珠单抗与阿替利珠单抗，其临床适应症主要针对没有EGFR/ALK突变的局部晚期或转移的NSCLC患者。这些因素都严重制约NSCLC患者总生存率的进一步改善。因此，发现与NSCLC恶性进展相关的新靶点并阐明其作用机制，是NSCLC临床靶向治疗所亟需解决的关键问题。<br>　　长链非编码RNA(longnoncodingRNA,lncRNA)是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA分子。虽然它们不编码蛋白质，但已经证实对基因表达调控、细胞生物学、发育生物学以及疾病发生等过程具有重要作用。近年来，lncRNA在包括癌症、神经退行性性变和心血管功能异常等多种人类疾病中的作用受到广泛关注与研究，目前，已报道多种lncRNA与NSCLC密切相关，在NSCLC恶性进展中发挥抑制或促进作用。例如，LINC00961、SPRY4-IT1、GAS6-AS1、MEG3在NSCLC组织中的表达水平相比于临近正常组织显著下调，并抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭与耐药。另一方面，AGAP2-AS1、LINC00673、ANRIL、HOTTIP、SNHG1在NSCLC组织中表达上调，并且与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期以及临床不良预后呈正相关。这些研究结果表明，lncRNA在NSCLC的发生、发展进程中具有重要作用。然而，目前关于lncRNA在NSCLC中生物学功能与分子机制研究仍远远不够。因此，发现与NSCLC恶性生物学行为相关的新lncRNA并揭示其作用机制，将为进一步探究肺癌复杂的肿瘤生物学特性以及促进靶向治疗策略的发展提供重要理论依据。<br>　　研究目的:<br>　　1.揭示LUAD肿瘤组织与临近正常肺组织中的lncRNA表达图谱，并筛选出LUAD肿瘤组织上调倍数最高的lncRNA(CLDN10-AS1);<br>　　2.验证CLDN10-AS1在LUAD临床样本与细胞系中的表达水平;<br>　　3.明确CLDN10-AS1表达水平对LUAD患者预后的影响;<br>　　4.阐明CLDN10-AS1在LUAD细胞增殖、迁移、侵袭与锚定非依赖性生长中的作用;<br>　　5.探究CLDN10-AS1调控LUAD恶性表型的作用机制。<br>　　研究方法:<br>　　1.选取7对LUAD癌组织及邻近正常组织进行RNA测序，通过生物信息学分析，获得lncRNA差异表达谱，筛选LUAD癌组织中上调倍数最高的lncRNA(CLDN10-AS1)为研究靶点;<br>　　2.分析TCGA数据库中的LUAD的测序数据，验证CLDN10-AS1在LUAD癌组织及临近正常肺组织中的表达水平;<br>　　3.通过Kaplan-MeierPlotter数据库分析CLDN10-AS1表达水平对LUAD患者总生存期(OverallSurvival,OS)、首次进展生存期(First-progressionSurvival,FPS)以及进展后生存期(Post-progressionSurvival,PPS)的影响;<br>　　4.选取1株正常支气管上皮细胞(BEAS-2B)与3株LUAD细胞(A549、H1975、H1650),提取RNA,应用RT-qPCR检测CLDN10-AS1表达水平;<br>　　5.构建CLDN10-AS1敲低质粒(sh-CLDN10-AS1)及空载对照(sh-NC),应用HEK293T细胞构建包含sh-CLDN10-AS1或sh-NC的慢病毒;应用上述慢病毒感染A549细胞，并筛选稳定CLDN10-AS1敲低细胞株(A549-sh-CLDN10-AS1,A549-sh-NC);<br>　　6.应用CCK8、Transwell、软琼脂克隆形成实验检测A549-sh-CLDN10-AS1,A549-sh-NC,细胞增殖、迁移、侵袭与锚定非依赖性生长能力;<br>　　7.应用Westernblot检测A549-sh-CLDN10-AS1,A549-sh-NC中c-Myc、E-Cadherin蛋白水平。<br>　　8.应用RNA-Seq检测A549-sh-CLDN10-AS1,A549-sh-NC细胞的转录图谱，应用生物信息学分析获得差异表达基因，并进行KEGG通路富集分析明确CLDN10-AS1调控的下游信号通路。<br>　　研究结果:<br>　　1.应用RNA-Seq检测7对LUAD肿瘤组织的转录组，以(|Log2FoldChange|＞2,Pvalue＜0.05)标准筛选差异表达基因，在LUAD肿瘤组织中275个lncRNA显著上调,90个lncRNA显著下调，其中CLDN10-AS1在LUAD肿瘤组织中上调倍数最高。<br>　　2.分析TCGA数据库中LUAD测序数据，结果显示LUAD肿瘤组织中的CLDN10-AS1相比于临近正常肺组织显著升高。<br>　　3.应用Kaplan-MeierPlotter数据库分析CLDN10-AS1表达水平对LUAD患者预后的影响，结果显示CLDN10-AS1高表达患者的OS、FPS、PPS显著缩短。<br>　　4.LUAD细胞系(A549、H1975、H1650)中CLDN10-AS1表达水平相比于人正常支气管上皮细胞(BEAS-2B)显著上调。<br>　　5.敲低CLDN10-AS1水平显著抑制了A549细胞增殖、迁移、侵袭与锚定非依赖性生长能力。<br>　　6.敲低CLDN10-AS1明显下调A549细胞中c-Myc蛋白水平，但增加E-Cadherin蛋白水平。<br>　　7.应用RNA-Seq检测A549-sh-CLDN10-AS1,A549-sh-NC细胞的转录图谱，按照(|Log2FoldChange|＞1,Pvalue＜0.05)标准，A549-sh-CLDN10-AS1相比于A549-sh-NC细胞共有1037个mRNA上调与535个mRNA下调,选取上述差异表达基因应用KEGG通路富集分析显示，敲除CLDN10-AS1会影响LUAD的Hippo信号通路、AMPK信号通路、DNA复制、RNA降解、RNA转运和一些经典代谢途径等相关通路。<br>　　研究结论:<br>　　1.CLDN10-AS1在LUAD中异常上调，且与患者不良预后密切相关。<br>　　2.敲低CLDN10-AS1表达显著抑制LUAD细胞的增殖、迁移、侵袭与锚定非依赖性生长。<br>　　3.CLDN10-AS1调控LUAD恶性表型的分子机制可能与细胞内Hippo和AMPK等经典通路改变有关。