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摘要口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是世界上第六大最常见的上皮恶性肿瘤，也是我国最常见的口腔恶性肿瘤之一。其发病率高、生存率低，且极易局部复发和远处转移。当前治疗OSCC的以手术治疗为主，放疗、化疗及中草药治疗为辅。尽管过去的几十年来肿瘤治疗手段日新月异，但居高不下的死亡率使OSCC成为了全球性的公共卫生难题，因此探寻新的治疗靶点至关重要。随着研究深入，越来越多的证据表明自噬在OSCC发生发展中具有不可或缺的作用。自噬(Autophagy)是一种在进化上古老且高度保守的分解代谢过程，它可以通过诱导Ⅱ型细胞死亡清除无用、多余或癌变的细胞，在维持机体内环境稳态方面发挥重要作用。但在细胞癌变之后，其自身的自噬水平和功能往往会发生改变，这种变化在不同肿瘤之间并不完全相同。现有研究发现OSCC的自噬水平明显低于癌旁组织，并在提高自噬水平后肿瘤生长明显受到抑制,这提示OSCC的恶性进展与自噬活性的变化密切相关，自噬或许是一种潜在的OSCC治疗靶点。苯乙双胍(Phenformin,Phen)是二甲双胍(Metformin,Met)的一种衍生物，研究发现二者皆具有广泛的抗肿瘤作用，且相同剂量下苯乙双胍抗癌作用更为显著。更值得重视的是，已有研究表明二甲双胍可使诱导癌变后的癌前细胞死亡，且该死亡与自噬关系密切。这提示同是双胍类药物，苯乙双胍的抗癌作用或许不局限于抑制增殖、促进凋亡等，其在调控自噬方面也发挥重要作用，但目前相关报道较少。我们之前的研究结果显示低浓度的苯乙双胍即可抑制OSCC细胞生长，但具体的分子机制尚未探讨,因此本课题将聚焦于探讨苯乙双胍是否通过调控自噬途径来发挥抗口腔鳞癌的作用及其潜在的分子机制。<br>　　实验目的：<br>　　(1)通过体内外实验明确苯乙双胍是否抑制口腔鳞癌细胞的生长。<br>　　(2)通过体内外实验明确苯乙双胍的抗癌作用主要通过促进肿瘤细胞自噬来实现的。(3)阐明苯乙双胍促进口腔鳞癌细胞自噬的分子机制。<br>　　实验方法：<br>　　(1)通过CCK-8实验探究苯乙双胍在调控口腔鳞癌细胞生长中的作用。<br>　　(2)分别通过EdU细胞增殖试剂盒、LC3单标荧光腺病毒、qRT-PCR、Western blot技术，探究苯乙双胍在体外调控口腔鳞癌细胞增殖、凋亡及自噬中的作用。<br>　　（3）通过裸鼠皮下成瘤实验探究苯乙双胍抑制口腔鳞癌生长的作用，并将成瘤实验所得肿瘤组织通过免疫荧光染色和免疫组化染色的方式评估增殖、自噬、凋亡相关指标,进一步验证体外实验结论。<br>　　（4）通过RNA测序分析苯乙双胍处理组与对照组的差异表达基因功能类别，筛选和鉴定相关的关键基因，并通过qRT-PCR、Western blot技术、体内实验肿瘤组织免疫荧光染色及免疫组化染色进行验证。<br>　　（5）通过在口腔鳞癌细胞中转染关键基因的siRNA,敲低关键基因表达水平，并通过qRT-PCR、Western blot技术检测低表达关键基因是否抑制苯乙双胍调节细胞自噬中的作用。<br>　　（6）通过查阅文献并结合RNA-seq分析结果探寻关键基因潜在的上下游通路，并应用相应抑制剂或转染siRNA降低基因表达量，利用qRT-PCR及Western blot技术从mRNA和蛋白水平来进行验证。<br>　　实验结果：<br>　　（1）CCK-8结果显示苯乙双胍显著抑制口腔鳞癌细胞生长，且随着浓度升高或处理时间延长抑制作用越显著;其次，苯乙双胍对口腔鳞癌细胞的IC50明显低于二甲双胍，这表明苯乙双胍抑制口腔鳞癌细胞生长的作用优于二甲双胍。<br>　　（2）体外实验结果显示苯乙双胍处理后，口腔鳞癌细胞中处于增殖中的细胞数目明显减少，凋亡率、凋亡指标及自噬指标表达显著升高，这表明苯乙双胍显著抑制口腔鳞癌细胞的增殖，并促进其凋亡与自噬。<br>　　（3）体内实验结果显示Phen组的肿瘤重量明显低于Con组，并且肿瘤组织中增殖指标表达明显降低、凋亡和自噬指标表达明显升高，这表明苯乙双胍抑制口腔鳞癌生长，并且在体内同样具有抑制口腔鳞癌细胞增殖、促进凋亡与自噬的作用。<br>　　（4）RNA测序结果表明苯乙双胍诱导表达改变的基因（差异基因）主要参与调节细胞自噬通路，并通过热图分析筛选出与自噬相关的关键基因:DDIT4和NIBAN1,并得到了体内外实验的验证。<br>　　（5）低表达DDIT4或NIBAN1可以显著抑制苯乙双胍促进口腔鳞癌细胞自噬的作用。<br>　　（6）Western blot结果显示苯乙双胍抑制mTOR通路的磷酸化，并在应用mTOR通路激活剂后抑制了苯乙双胍促进自噬的作用;其次，使用siRNA敲低AMPKα后并未影响DDIT4和NIBAN1的表达，而敲低ATF4表达显著抑制了 DDIT4和NIBAN1的表达及苯乙双胍促进自噬的作用，这表明苯乙双胍通过ATF4上调DDIT4和NIBAN1的表达以抑制mTOR信号通路促进口腔鳞癌细胞自噬。<br>　　结论：<br>　　本研究发现，与二甲双胍相比，苯乙双胍拥有更强的抑制口腔鳞癌细胞生长的作用。苯乙双胍在体外、体内均可抑制口腔鳞癌细胞的增殖，促进凋亡和自噬。RNA测序结果显示苯乙双胍诱导的差异基因主要参与调节细胞自噬通路并筛选出自噬通路关键基因:DDIT4和NIBAN1,表明苯乙双胍主要通过诱导口腔鳞癌细胞自噬发挥作用。分子机制研究显示苯乙双胍通过ATF4调控DDIT4和NIBAN1表达来抑制mTOR信号通路促进口腔鳞癌细胞自噬。本研究为研发靶向诱导口腔鳞癌细胞自噬的治疗手段提供理论基础。