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摘要研究背景:<br>　　胃癌是世界范围内最常见的消化道恶性肿瘤之一，是全球第五大常见的癌症和第四大常见的癌症死亡原因。近年来多项研究表明人类微生物组和癌症发展之间存在相互作用，已经证明不同肿瘤类型特异性的细胞内微生物是肿瘤微环境不可或缺的部分，可为临床癌症诊断及分期提供信息，这明确了肿瘤内微生物组在癌症发生和发展中的重要性和可变性。微生物及其功能基因可发挥促进致癌作用，但不足以导致癌症，这一机制的实现需要调控下游靶点来影响肿瘤进展和治疗效果。宿主异常甲基化作为胃癌的早期事件，是微生物及其代谢产物的潜在靶点，即微生物群——宿主表观遗传轴。已有研究表明小鼠肠道微生物群可通过改变早期炎症应答基因的局部DNA甲基化，进一步调控肠道稳态。结直肠癌癌组织内的微生物对宿主体内关键基因甲基化修饰的调控部分解释了结直肠癌的发病机制。胃癌组织中也存在特定的微生物和宿主异常甲基化改变，已被用作生物标志物和潜在干预靶点，对癌症的发生、进展和治疗反应产生影响。以上研究表明，肿瘤内微生物群和宿主异常甲基化之间的相互作用，并进一步对胃癌的发展和预后的影响是值得探讨的科学问题。目前，对肿瘤内细菌的研究大多只关注微生物组成的差异，而微生物的基因组成有助于进一步探讨微生物参与胃癌发生发展的机制。<br>　　在本研究拟基于癌症基因组图谱(TheCancerGenomeAtlas,TCGA)的胃腺癌(StomachAdenocarcinoma,STAD)项目的RNA测序数据，获得患者肿瘤内微生物组成图谱，并探索参与胃癌发生、发展及与生存相关的微生物及其功能基因和富集功能通路。对比是否发生远端转移患者的宿主DNA甲基化改变，筛选相关异常甲基化改变，并获得有预后预测价值的异常甲基化改变。基于上述分析进一步探索微生物特征和甲基化特征是否双向介导彼此对胃癌的发展和预后的贡献，并用过细胞实验验证关键发现。<br>　　材料与方法:<br>　　本研究数据来源为已申请的TCGASTAD项目的RNABam测序文件、RNA计数数据及相应临床数据，共375名患者的407例样本;TCGASTAD项目的HumanMethylation450数据，共368名患者的癌组织样本。使用samtools、Kraken2、eggNOG-Mapper和PICRUSt等软件进行微生物数据提取、过滤、比对及质量控制流程，获得胃癌患者的微生物组成图谱，包括微生物物种组成、微生物功能基因及其KEGG富集通路等。<br>　　分别以样本组织类型、癌细胞是否发生远端转移及患者生存结局为分组，比较微生物alpha多样性、beta多样性差异,LEfSe及Boruta-RandomForest筛选关键差异微生物，使用MetagenoNets平台构建微生物互作网络。基于癌细胞是否发生远端转移及患者生存结局为分组，使用limma对预处理后的甲基化信号值矩阵做差异分析、Bumphunter算法筛选差异甲基化区域和EpiMod算法筛选表观遗传功能模块。使用DAVID平台对存在异常甲基化的基因进行KEGG功能富集分析。单因素Cox回归和/或LASSO-Cox筛选与生存相关的宿主异常甲基化、微生物及其功能基因和富集的KEGG通路。最后分别使用中介分析和生存中介分析探索相关微生物特征和宿主DNA甲基化特征之间的相关作用，及其进一步对患者发生远端转移及生存预后的关联，并使用Cytoscape进行可视化。<br>　　使用RT-qPCR检测ZNF215基因的表达，WesternBlot检测ZNF215蛋白的水平。CCK-8细胞增殖实验和细胞克隆形成实验用于评估对HGC-27、AGS和GES-1人体胃组织细胞的增殖和侵袭能力的影响。<br>　　研究结果:<br>　　首先，本研究绘制了胃癌变组织的微生物组成图谱。经质控和去除污染后，共鉴定出1168个属、4004个种水平的细菌、7067个微生物功能基因和213条KEGG功能富集通路用于后续分析。<br>　　其次，肿瘤内微生物群与STAD的发生、远处转移和预后有关。癌变组织的微生物alpha多样性显著低与邻近正常组织，且两组间微生物群落结构组成差异显著。共鉴定出120个在属和种水平上的差异丰富分类群（LEfSe）和55个差异表达的功能基因（FDR＜0.10）。Boruta-RandomForest分析基于差异微生物进一步筛选出了16个癌组织相关微生物特征并构建了分类诊断模型，其AUC=0.931,AUPR=0.930。LEfSe分析筛选出23种在癌细胞发生远端转移和未发生远端转移两个组间差异的微生物，Wilcoxon秩和检验筛选出了13个组间差异表达的微生物功能基因，且癌细胞发生远端转移组内的微生物共现网络的复杂度更高。单变量Cox回归及进一步的LASSO-Cox回归筛选出13个有潜在预后预测价值的微生物，可较好预测患者3年内的生存率，同时11个功能基因与STAD患者的预后相关。<br>　　再次，宿主癌组织的异常DNA甲基化与患者癌细胞发生远处转移和预后相关。基于是否发生远端转移分组，组间共筛选出4799个差异甲基化位点、14个均在发生转移组中异常高水平的DNA甲基化区域和7个差异表观遗传功能模块。发生异常DNA甲基化水平改变的基因多富集于癌症相关通路。基于单变量Cox回归分析（FDR＜0.25）,共12个差异甲基化位点和45个差异甲基化区域被鉴定为潜在的预后相关的DNA甲基化。多变量Cox回归进一步表明，基于LASSO-Cox回归筛选的8个差异甲基化位点或14个差异甲基化区域构建的预后模型可预测患者5年内的生存率。<br>　　研究结果表明微生物组和宿主甲基化之间的双向中介作用和胃癌发展及预后相关。相关性分析显示甲基化特征和微生物特征之间高度显著相关。基于与癌细胞远端转移相关的微生物特征和宿主DNA甲基化特征，双向中介分析揭示与胃癌远端转移相关的20种潜在中介关联。相互作用网络显示甲基化特征可能倾向于通过影响肿瘤内微生物群的丰富度或均匀度来进一步促进癌细胞的远处转移。解糖葡萄球菌和ZNF215基因的部分区域的甲基化水平之间可能存在双向中介作用，且解糖葡萄球菌也介导了PTGS2基因的部分区域异常甲基化对转移的影响。基于与患者生存相关的微生物特征和宿主DNA甲基化特征，生存中介分析揭示了微生物特征和甲基化特征之间的51种潜在中介关联。例如，坐皮肤球菌可能通过影响9种甲基化特征而影响患者生存，同时该微生物也可能介导这9种甲基化特征对预后的影响。<br>　　细胞实验结果显示解糖葡萄球菌通过提高ZNF215基因和蛋白的表达水平，增加胃细胞系的细胞克隆数和活细胞数。ZNF215基因表达的沉默则会降低胃细胞系的细胞克隆数和活细胞数。<br>　　研究结论:<br>　　我们的分析揭示了胃癌患者肿瘤相关微生物物种组成、功能基因组成和富集功能通路的图谱。幽门螺杆菌和其他癌症相关微生物可能促进STAD的发生、发展或预后。此外，癌细胞发生远处转移的患者的癌组织存在异常DNA甲基化改变，且异常DNA甲基化对生存状况有预测能力并富集于癌症相关KEGG通路。解糖葡萄球菌可以通过调控ZNF215基因的表达水平来促进胃组织细胞的增殖和克隆。肿瘤内微生物和宿主表观遗传学之间的中介作用是胃癌患者胃组织肿瘤微环境中癌细胞远处转移和生存不良的关键。