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摘要巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)已经被广泛应用于外源蛋白的表达和功能研究。虽然毕赤酵母全基因组已经被测序，但是其基因操作工具系统仍不完善，且在毕赤酵母上的遗传工程改造进展也较为缓慢。CRISPR-碱基编辑器是一种基于CRISPR/Cas9系统的基因编辑工具，它能够实现基因组特定位点上的单碱基变换，是近年来基因工程方向发展最为迅速的技术之一。本研究在毕赤酵母中建立了一套高效的CRISPR-碱基编辑器工具集，并详细分析了不同碱基编辑器在毕赤酵母细胞中的编辑模式和编辑效率。此外,利用所建立的胞嘧啶碱基编辑器，我们初步探讨了其在nCas9(nickCas9)蛋白体外进化研究中的应用。<br>　　首先，通过胞嘧啶脱氨基酶(PmCDA1)与nCas9不同的融合表达方式、连接肽长度及不同长度靶向序列的gRNA设计了一系列毕赤酵母上的胞嘧啶碱基编辑器(cytosinebaseeditor,CBE)。结果表明，CBE的编辑窗口位于前间隔序列邻近基序(protospaceradjacentmotif,PAM)远端的C20～C14之间，其中C18的编辑效率最高，可达85.1％。且当连接肽长度为(GGGGS)10时，CBE的编辑效率最高。nCas9与PmCDA1相对位置的改变对CBE编辑效率和编辑模式的影响不明显。此外，gRNA靶向序列长度低于17nt时，CBE无碱基编辑活性，而该长度为19nt～23nt时，CBE均具有较高的编辑效率。本部分，成功在毕赤酵母中建立了高效的胞嘧啶碱基编辑器，明确了连接肽和gRNA的长度对CBE编辑效率的影响，为其他类型碱基编辑器的设计和构建奠定了基础。<br>　　基于CBE构建成功的实验基础，随后本研究通过连接肽(GGGGS)10将ABE8e分别融合在nCas9的N和C端，构建了两种腺嘌呤碱基编辑器(adeninebaseeditor,ABE)。结果表明，二者均能实现对毕赤酵母基因组碱基A→G的高效编辑，且编辑窗口均位于PAM基序远端的A18～A7之间，其中A16的编辑效率最高可达98.83％。本部分，成功在毕赤酵母中建立了高效的腺嘌呤碱基编辑器，为进一步构建双碱基编辑器提供经验基础。<br>　　随后，本研究尝试构建nCas9与PmCDA1/ABE8e同时融合表达的双碱基编辑器。采用两种不同的策略:一种是将PmCDA1与ABE8e先融合，然后将PmCDA1-ABE8e放在nCas9的N端,命名为CABE;另一种策略是将PmCDA1与ABE8e分别置于nCas9的N端和C端，命名为ACBE。结果表明，两种方式获得的双碱基编辑器的编辑模式有所不同。CABE的编辑窗口为PAM远端A20～A13位，C17位的编辑效率为20.32％,A16位的编辑效率可达70.2％;ACBE的编辑窗口为PAM远端A20～A7位，C17位的编辑效率为38.1％,A16位的编辑效率可达88.92％。本部分，成功在毕赤酵母中建立了双碱基编辑器，实现了酵母基因组中同靶点区域内碱基A与C的同时编辑，进一步丰富了毕赤酵母的基因编辑工具库。<br>　　最后，本研究通过CBE对nCas9进行改造。我们利用GUT1基因被编辑后会导致毕赤酵母在以甘油为碳源的平板上生长缓慢而建立了Cas9功能-表型相联系的快速筛选模型;设计了94条靶向nCas9的gRNA,并将其一起电转入酵母细胞，以对整合在毕赤酵母基因组中的nCas9进行随机突变;利用微生物高通量自动化平台筛选了11450个克隆，最终得到49个保留nCas9活性的突变体。本部分，首次在酵母中利用CBE随机改造nCas9蛋白，这为在酵母中定向进化外源蛋白和推动酵母自身的改造提供借鉴。<br>　　综上所述，本研究在毕赤酵母中构建了一套具有高效编辑活性的碱基编辑器，并初步探讨了CRISPR-碱基编辑器在遗传突变和分子进化方面上的应用，有望进一步加快基于毕赤酵母的药物筛选和外源蛋白进化等基础和应用研究。