急性冠脉综合征瘀毒互结证大鼠模型的建立及清心解瘀方对其干预机制研究-论文-万方医学网

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急性冠脉综合征瘀毒互结证大鼠模型的建立及清心解瘀方对其干预机制研究

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摘要冠心病(coronaryarterydisease,CAD)是目前世界范围内严重危害人类健康和生命的心血管疾病，其死亡率逐年上升。急性冠脉综合征(acutecoronarysyndrome,ACS)是冠心病的一种严重类型，也是导致冠心病患者死亡的主要原因，几乎一半的冠心病患者死亡发生于急性冠脉综合征之后。冠状动脉血管管壁斑块的形成及破裂是ACS发生及发展的病理基础。急性冠脉综合征属中医“胸痹”范畴。瘀毒互结是冠心病重要病机，“瘀毒”一方面是包含“血瘀”和“毒邪”并存的病理状态，这里的“毒”概括为危害性较大的病邪;另一方面是指血瘀日久而酝酿生毒。 　　动物模型是深入研究疾病机制的重要载体。相比较西医使用的单因素“病”的模型，中医病证结合模型更能体现中医“证”的特点，相对更贴近于临床，是研究中医基础与进行新药研发的重要手段。基于不同的中医证型建立的冠心病病证结合动物模型有多种方式，但是迄今为止关于冠心病瘀毒互结证动物模型的研究报道较少。本团队前期成功建立了冠心病气虚血瘀证大鼠模型、小型猪冠心病痰瘀互结证模型，在病证结合动物模型的研究和操作方面有着丰富的经验。本实验将在拟临床研究思路指导下，根据项目组临床研究总结的瘀毒互结证生物表征,选用复合因素造模的方式，以SD大鼠为研究对象，首次采用冠脉结扎结合注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的方法来尝试建立急性冠脉综合征瘀毒互结证模型。 　　清心解瘀方是临床上治疗ACS的代表方，源自国医大师陈可冀院士治疗急性心肌缺血的经验方—“愈梗通瘀汤”的化裁，具有益气化浊，活血解毒的功效。因此本研究用清心解瘀方“以方测证”来验证动物模型建立可靠性，并对该方活血解毒保护ACS的作用机制开展研究。 　　第一部分急性冠脉综合征瘀毒互结证大鼠模型的建立 　　一、目的 　　根据ACS的病理生理特点和临床ACS瘀毒互结证生物表征，在不同的造模时长下，分别比较单因素造模、先毒后瘀造模、先瘀后毒三种造模方式，探寻最优的急性冠脉综合征瘀毒互结证大鼠模型造模方法。 　　二、方法 　　随机将SD雄性大鼠分为四组:（1）假手术组;（2）单因素造模组，单纯结扎冠脉;（3）先毒后瘀造模组，腹腔注射脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）24h后结扎冠脉;（4）先瘀后毒造模组，结扎冠脉10min后腹腔注射LPS。基于“缺血性心血管病瘀毒互结证的临床诊断标准”设置各项评价指标。分别于造模3h、24h、3d后，观察各组大鼠的一般状态、舌象及脉象等中医证候指标，用心电图监测心肌缺血情况、小动物心脏超声检测心功能，心肌伊文思蓝/TTC染色检测心肌缺血、梗死面积，检测心肌酶CK、CK-MB、LDH以及肌钙蛋白T含量评价心肌损伤程度，检测血小板聚集率、凝血四项（APTT、PT、TT、FIB）、血液流变学评价血瘀水平，检测白细胞数量、血清炎症因子IL-1β、IL-6的含量评价“毒”邪程度，使用苏木素-伊红（HE）染色观察心肌组织形态。 　　三、结果 　　造模3h后，单因素造模组大鼠的脉搏幅度、舌面R、G、B值较假手术组明显下降，舌下络脉颜色加深，ST段抬高，心功能下降，血清炎症因子IL-1β、IL-6以及心肌酶CK、LDH、肌钙蛋白T水平明显上升，白细胞总数和心肌梗死面积明显增加;与单因素造模组相比，先毒后瘀组、先瘀后毒组舌面R值下降，舌下络脉增长，肌钙蛋白T水平上升，且先瘀后毒组舌面B值亦降低，血清IL-1β的水平增高。HE染色结果显示假手术组心肌排列整齐，各模型组心肌间隙有少量炎细胞浸润，但与假手术组差别不大。 　　造模24h后，单因素造模组大鼠脉搏幅度、舌面R、G、B值、心功能相较于假手术组明显下降，舌下络脉增长、颜色变暗，白细胞总数、心肌梗死面积增多，纤维蛋白原、全血黏度与血小板聚集率增高，凝血酶时间、凝血酶原时间明显缩短，心肌酶CK、LDH以及肌钙蛋白T、IL-6水平升高。相较于单因素造模组，先毒后瘀与先瘀后毒造模组脉搏幅度与舌面R、G、B值降低，舌下络脉紫暗且长度增长，心脏EF、FS降低，cTnT含量升高，此外，先瘀后毒造模组的心肌梗死面积、血小板聚集率、白细胞总数、心肌酶LDH以及炎症因子IL-1β水平也明显增加。HE染色结果显示假手术组心肌排列整齐，少有轻微间隙，各模型组心肌纤维排列疏松，有轻度断裂，存在大量炎细胞浸润;先毒后瘀造模组和先瘀后毒造模组的炎细胞浸润情况较单因素造模组明显。 　　造模3d后，与假手术组相比，单因素造模组脉搏幅度明显降低，舌面R、G、B值下降，舌下络脉加粗增长，心功能下降，cTnT含量增加，纤维蛋白原含量上升，血小板聚集率与全血黏稠度增高，血清炎症因子IL-1β、IL-6水平上升;与单因素造模组比较，先毒后瘀造模组、先瘀后毒造模组舌下络脉颜色加深加长,血清cTnT含量上升;此外，先瘀后毒造模组的脉搏幅度、舌面R、G、B值、心脏EF、FS分数明显下降，心肌梗死面积显著增大。但是三个模型组的心肌酶水平对比假手术组均无明显差异。HE染色结果显示假手术组心肌纤维排列较好,各模型组出现纤维细胞增生，中性粒细胞分布广泛，先瘀后毒造模组病变情况重于先毒后瘀造模组和单因素造模组。 　　四、小结 　　从选择造模时长的角度分析，造模3h后三种造模方式制备的模型在低中高切变率下的全血黏度、血小板聚集率相较于假手术组均没有显著改变，不完全符合血瘀的特征。造模24h后，相较于假手术组和其他两个模型组，先瘀后毒造模组的大鼠心功能明显下降，血清炎症因子以及血小板聚集率明显升高。造模3d后，三个模型组大鼠的血清心肌酶水平较假手术组无统计学差异，这表明造模3d后疾病开始从急性期进入恢复期，不符合急性心肌缺血的病理特点以及瘀毒互结证发病骤急的证候特征。因此选用先瘀后毒(冠脉结扎后10min注射LPS)方法，造模24h建立的大鼠模型更加符合急性冠脉综合征瘀毒互结证的证候表现及疾病特征。 　　第二部分LPS注射剂量对急性冠脉综合征瘀毒互结证大鼠模型的影响 　　一、目的 　　在前期筛选出冠脉结扎后注射LPS造模方式的基础上，观察LPS注射剂量对建立急性冠脉综合征瘀毒互结证模型的影响，探索最佳的造模剂量。 　　二、方法 　　随机将SD雄性大鼠分为5组:(1)假手术组(2)单因素造模组(3)LPS小剂量组(2.5mg/kg),(4)LPS中剂量组(5mg/kg),(5)LPS大剂量组(10mg/kg)。单因素造模组采用结扎冠状动脉左前降支的方式造模，LPS小、中、大剂量组采用结扎冠脉左前降支10min后腹腔注射不同剂量LPS的方式造模。造模24h后，观察各组大鼠的舌象、脉象、尾部血流灌注情况，使用小动物心脏超声评价各组的心功能，用TTC染色法检测心肌梗死面积，检测血清cTnT含量及炎症因子超敏C反应蛋白(Hs-CRP)、LPS、IL-1β、IL-6的水平，检测血常规、凝血五项、血小板聚集率、血液流变学等凝血评价指标，HE染色观察心肌组织形态变化。 　　三、结果 　　假手术组各项指标均为正常水平。与假手术组比较，单因素造模组及LPS小、中、大剂量组的脉搏幅度、舌面RGB值、尾部血流灌注量均降低，舌下络脉扩张，心功能下降，血小板聚集率与全血黏度、纤维蛋白原含量、血清cTnT及炎症因子IL-1β、Hs-CRP、LPS含量上升，心肌梗死面积增大，此外LPS小、中、大剂量组的血清IL-6含量显著上升，凝血酶、凝血酶原时间缩短，凝血酶原活动度增高，而单因素造模组的血清IL-6含量与凝血酶、凝血酶原时间、凝血酶原活动度和假手术组相比未见显著性差异。 　　与单因素造模组比较，LPS小剂量组的脉搏幅度明显降低，血清IL-1β水平升高，其他指标检测结果分析未见统计差异;LPS中、大剂量组脉搏幅度、舌面RGB值、尾部血流灌注量、左心室射血分数与缩短分数明显下降，舌下络脉增长、紫暗，血小板聚集率、血清cTnT、IL-1β、IL-6、LPS含量升高，心肌梗死面积明显增大。HE染色结果显示，假手术组的心肌纤维排列整齐，各模型组心肌纤维间隙增宽，有大量炎细胞浸润，LPS中、大剂量组炎症范围累计较单因素造模组、LPS小剂量组增大。 　　四、小结 　　LPS小剂量组各项指标的检测结果与单因素造模组相比差异不大，而LPS中、大剂量组的心功能下降水平、“血瘀”程度与炎症因子释放相较于单因素造模组、LPS小剂量组更为严重，比较符合瘀毒互结证血瘀与毒邪并重，发病急骤,病情严重的特征。LPS中剂量组和LPS大剂量组的病变情况相似。因此选择在冠脉结扎后注射LPS中剂量(5mg/kg)进行造模的方式制备ACS瘀毒互结证模型。 　　第三部分急性冠脉综合征瘀毒互结证大鼠模型的可靠性评价及清心解瘀方保护ACS机制研究 　　第一节以方测证验证急性冠脉综合征瘀毒互结证大鼠模型的可靠性 　　一、目的 　　验证急性冠脉综合征瘀毒互结证大鼠模型的可靠性。 　　二、方法 　　以本实验前两部分建立的急性冠脉综合征瘀毒互结证大鼠模型为研究对象,采用以方测证的方法来验证模型的可靠性。分别使用对证的活血解毒药物及不对证的温中祛寒药物干预模型，通过药效学结果评价模型。实验分为6组:(1)假手术组;(2)模型组;(3)四逆汤组(方证不应组)，给予四逆汤4.32g/kg;(4)清心解瘀方大剂量组(方证相应组)，给予清心解瘀方3.96g/kg;(5)清心解瘀方小剂量组,给予清心解瘀方1.98g/kg;(6)阳性药组,给予替格瑞洛32.4mg/kg。预防给药5天。检测各组舌象、脉象、心功能、心肌梗死面积、血清cTnT含量，观察尾部血流灌注情况，检测血小板聚集率、血液流变学、血常规，使用HE染色观察心肌组织形态学，电镜观察心肌超微结构。综合评价模型的准确性。 　　三、结果 　　假手术组大鼠舌淡红，苔薄白，脉象平稳有力度，各项指标均为正常水平。相较于假手术组，模型组大鼠的脉搏幅度、舌面RGB值、尾部血流灌注量显著降低，舌色紫暗，舌下络脉紫黑、扩张，心功能下降明显，红细胞体积分布分数、血小板计数、血小板比积、血小板聚集率与全血黏度、血清cTnT含量均明显上升，心肌梗死面积显著增大。 　　与模型组相比，清心解瘀方大剂量组和四逆汤组的脉搏幅度都明显提升，但四逆汤组的大鼠舌象表现与模型组无明显差异。清心解瘀方大剂量组的大鼠舌色淡红，舌面RGB值上升，舌下络脉缩短、颜色变浅，趋于假手术组水平，尾部血流灌注量明显提高。清心解瘀方大、小剂量组及阳性药组大鼠心率、左室射血分数、短轴缩短率、心输出量与每搏输出量较模型组均明显提高，而四逆汤组仅提高了心率和心输出量，其他心功能指标没有明显改善现象。所有给药组的全血黏度、血清cTnT含量都较模型组明显下降，此外清心解瘀方大、小剂量组、阳性药组还可以显著降低红细胞体积分布分数、血小板计数、血小板比积与血小板聚集率，减少心肌梗死面积，而四逆汤这些指标无明显改善作用。 　　HE染色结果表明假手术组心肌纤维排列较整齐，模型组心肌纤维排列紊乱,纤维间隙明显增宽，伴有大量炎细胞浸润和局灶性心肌坏死;与模型组比，所有给药组均可减少心肌损伤范围及炎细胞数量，四逆汤组心肌损伤整体范围虽然较模型组有所减轻，但病变重于清心解瘀方大剂量组。电镜观察显示假手术组心肌纤维排列整齐，线粒体结构完整，模型组心肌纤维紊乱、溶解，线粒体肿胀;与模型组比较，清心解瘀方大剂量组（方证相应组）、清心解瘀方小剂量组阳性药组肌纤维排列相对整齐，四逆汤组（方证不应组）肌纤维严重溶解，较模型组相比更差。 　　四、小结 　　根据中医“有是证用是方”的辨证论治原则判断模型建立的可靠性。方证相应的清心解瘀方大剂量组可以改善ACS瘀毒互结证模型的心功能，减少心肌梗死面积，减少血瘀和组织中性粒细胞分布，显示出活血解毒功效;而方证不应的四逆汤组作为治疗心肌缺血的中药，有着温中散寒的作用，虽然一定程度上也有改善模型的心功能，但活血作用较差，血瘀仍然严重,用药后心肌组织排列较乱，对急性冠脉综合征瘀毒互结证模型大鼠的治疗效果明显不如方证相应组，说明药不对证。本研究初步证明冠脉结扎10min后注射LPS的方法制备的急性冠脉综合征瘀毒互结证模型基本可靠。 　　第二节基于转录组学研究清心解瘀方治疗急性冠脉综合征瘀毒互结证的潜在基因 　　一、目的 　　通过转录组测序筛选出清心解瘀方治疗急性冠脉综合征瘀毒互结证的潜在基因靶点。 　　二、方法 　　使用第一节实验假手术组、模型组、清心解瘀方大剂量组所取组织的心肌进行转录组测序，对测序结果进行聚类分析、基因表达差异分析、GO功能分析和KEGG富集通路分析。分析急性冠脉综合征瘀毒互结证的发生引起的生物学功能改变及影响的通路，推测清心解瘀方干预的潜在生物过程与机制。比对清心解瘀方组与模型组之间的差异mRNA基因，筛选出清心解瘀方调控急性冠脉综合征瘀毒互结证的关键信号通路与潜在基因靶点。 　　三、结果 　　模型组较假手术组共上调1585个基因，下调1469个基因;清心解瘀方组较模型组共上调204个基因，下调102个基因。GO功能分析表明:与假手术组比，模型组的线粒体、免疫受体活性、氧化还原过程等生物过程发生改变。清心解瘀方可能主要通过调节心脏收缩、血液循环等生物过程发挥作用。KEGG富集通路分析结果显示模型组大鼠与假手术组大鼠心肌组织的差异基因主要富集在的TNF信号通路、趋化因子信号通路、IL-7信号通路等，与中性粒细胞外陷阱形成、造血细胞谱系等有关;清心解瘀方组与模型组差异基因主要富集在免疫反应与炎症相关信号通路。筛选出7个清心解瘀方逆转的高表达基因:Ly6e、CD14、TLR4、NFKBIZ、REL、RELA、RELB,其对应Ly6e/CD14/TLR4/NF-Bp65信号通路。 　　四、小结 　　转录组学结果表明清心解瘀方主要通过影响免疫反应与炎症相关通路来改善急性冠脉综合征瘀毒互结证。清心解瘀方可能调控Ly6e、CD14、TLR4、NFKBIZ、REL、RELA、RELB等基因的表达，推测其可以通过Ly6e/CD14/TLR4/NF-κBp65信号通路发挥作用。 　　第三节清心解瘀方治疗急性冠脉综合征瘀毒互结证的作用机制研究 　　一、目的 　　基于转录组学的结果研究清心解瘀方治疗急性冠脉综合征瘀毒互结证的作用机制，并验证其是否通过调控Ly6e/CD14/TLR4/NF-κBp65信号通路发挥作用。 　　二、方法 　　对第一节实验部分预留的假手术组、模型组、清心解瘀方大剂量组、清心解瘀方小剂量组、阳性药组大鼠的血清与心肌组织的进行检测。Elisa法检测血清炎症因子LPS、IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α含量;qRT-PCR法检测转录组学筛选出的清心解瘀组与模型组之间差异表达显著性大、表达量高的基因Ly6e、CD14、TLR4、NFKBIZ、REL、RELA、RELB的mRNA水平，免疫组化检测心肌组织CD14蛋白表达情况;使用Westernblot法检测转录组学筛选出的差异基因对应的蛋白Ly6e、CD14、TLR4、pNF-κBp65、NF-κBp65表达水平。 　　三、结果 　　与假手术组比较，模型组血清LPS、IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α含量显著升高;与模型组比较，而清心解瘀方大、小剂量组以及阳性药组均可显著降低血清LPS、IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α含量。 　　qRT-PCR检测结果表明，与假手术组比较，模型组显著上调了免疫与炎症相关基因Ly6e、CD14、TLR4、NFKBIZ、REL、RELA、RELB的mRNA水平;与模型组比较，清心解瘀方可以将Ly6e的MRNA调控至正常水平，降低REL的mRNA表达水平，对CD14、TLR4、NFKBIZ、RELA、RELB的mRNA表达也呈现下调趋势。免疫组化结果显示，模型组CD14蛋白表达水平较假手术组显著升高;与模型组比较，清心解瘀方大剂量组、小剂量组及阳性药组均可以降低CD14蛋白的表达强度。WB检测显示，模型组心肌组织的Ly6e、CD14、TLR4、p-NF-κBp65蛋白表达量较假手术组显著上调;与模型组比较，清心解瘀方大剂量和阳性药可以明显下调Ly6e、CD14、TLR4、p-NF-κBp65的表达水平，清心解瘀方小剂量可以降低Ly6e、TLR4、CD14表达量，对p-NF-κBp65蛋白表达有降低趋势。 　　四、小结 　　清心解瘀方治疗ACS瘀毒互结证的作用机制可能与调控Ly6e/CD14/TLR4信号通路，减少NF-κBp65磷酸化，减少炎症因子释放有关。 　　结论 　　使用冠脉结扎大鼠心脏后10min腹腔注射LPS(5mg/kg)的方式造模24h可以成功制备既符合急性冠脉综合征疾病表征、又符合瘀毒互结证证候特征的ACS瘀毒互结证大鼠模型。清心解瘀方可以通过降低血小板比积与聚集率、调控Ly6e/CD14/TLR4炎症信号通路、降低NF-κBp65磷酸化水平，减少多种血清炎症因子释放，而发挥活血解毒之功效。