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摘要缺血性心脏病(Ischemiaheartdisease,IHD)是当前世界范围内致死和致残的重要原因，中国心血管病死亡是城乡居民主要死亡原因之一。恢复血流灌注是治疗IHD最有效且最重要的方法，但恢复血流灌注造成的心肌缺血再灌注损伤(Myocardialischemiareperfusioninjury,MIRI)是治疗缺血性心脏病过程中影响血运重建后患者即时生存率和远期心功能恢复的重要因素。目前临床上尚无治疗MIRI的首选特效药。既往研究发现,MIRI的发病机制有氧化应激失衡、钙超载、线粒体损伤、能量代谢障碍、自噬、凋亡、炎性反应等，且这些病理机制间相互交错，互为因果。其中，炎症反应贯穿缺血再灌注后心肌损伤和修复全过程，是决定最终心肌梗死大小和不良心肌重构的关键因素之一，是改善MIRI临床结局的关键治疗靶点。细胞焦亡是细胞死亡与炎症反应直接的、紧密的联系者，也是主要引起MIRI炎症反应的死亡方式之一，NLRP3炎症小体的形成和激活是介导MIRI细胞焦亡和炎症反应的关键步骤，因此，调控NLRP3的激活是调控心肌缺血再灌注损伤及炎症反应的关键策略。<br>　　双参宁心胶囊(ShuangshenNingxin,SSNX)是由人参总皂苷、丹参总酚酸和延胡索总生物碱组成的益气活血组分中药，具有益气活血、祛瘀止痛之功，主要用于治疗缺血性心脏病。前期研究发现SSNX对急性心肌梗死、心肌缺血再灌注损伤(Myocardialischemia-reperfusioninjury,MIRI)和冠脉微循环障碍具有较好的保护作用，其机制主要包括抑制细胞自噬、改善线粒体功能、减少细胞凋亡等，但其抗炎作用研究较少，抗炎机制不清。因此，本研究拟建立大鼠急性MIRI模型，探索SSNX的抗炎作用和对NLRP3炎症小体及其介导的细胞焦亡的影响,并通过转录组和生信分析技术筛选和寻找SSNX调控NLRP3的通路和靶点，最后验证SSNX及其有效组分对调控NLRP3相关的通路和关键靶点的影响。阐明双参宁心胶囊保护MIRI的抗炎机理，完善双参宁心胶囊的药效机制。<br>　　目的：<br>　　①明确双参宁心胶囊对NLRP3炎症小体及其介导的细胞焦亡和炎症反应的调控作用。<br>　　②探索和验证双参宁心胶囊调控NLRP3炎症小体的通路和靶点，阐明双参宁心胶囊防治MIRI的作用机制。<br>　　方法：<br>　　1.SSNX对急性MIRI大鼠的保护作用和抗炎作用研究<br>　　建立大鼠急性MIRI模型，分为假手术组(Sham)、模型组(Model)、SSNX90mg/kg组、SSNX45mg/kg组、尼可地尔组(NIC)和通心络组(TXL)。分析大鼠舌象，脉搏仪检测脉搏幅度，超声心动图检测大鼠心功能，声学造影检测大鼠心肌血流灌注达峰时间，HE染色观察心肌组织病理，依文思蓝染色、TTC染色、硫磺素染色后观察和计算心肌梗死面积和无复流面积，同时检测大鼠血浆凝血四项APTT、PT、TT、FIB,生化法检测大鼠血清心肌酶CK、CK-MB、LDH、AST和ALT含量，多因子检测大鼠血清IL-6、MCP-1、TNF-α等炎症因子含量，蛋白免疫印迹法检测心肌组织中NF-κB、TLR4、IL-1β,NLRP3蛋白的表达。<br>　　2.SSNX对急性MIRI大鼠心肌NLRP3介导的细胞焦亡和炎症反应影响研究<br>　　建立大鼠急性MIRI模型，分为Sham组，Model组，SSNX90mg/kg组，MCC950组。ELISA法检测大鼠血清炎症因子IL-18、IL-1β含量，免疫组化法检测大鼠心肌GSDMD、NLRP3、Caspase-1蛋白表达，免疫荧光法检测大鼠心肌ASC、NLRP3双染和NLRP3、GSDMD双染蛋白表达，免疫印迹法检测大鼠心肌组织ASC、NLRP3、Pro-Caspase-1、Caspase-1、GSDMD、GSDMD-N、IL-1β、IL-18蛋白表达。<br>　　3.SSNX对NLRP3/caspase-1/GSDMD细胞焦亡通路调控作用研究<br>　　构建NLRP3过表达的H9C2心肌细胞株(NLRP3-H9C2),建立H9C2和NLRP3-H9C2细胞缺氧缺糖/复氧复糖(OGD/R)损伤模型,分为正常对照组(NC),OGD/R损伤的H9C2心肌细胞组(OGD/R),SSNX干预OGD/R组(SSNX),OGD/R损伤的NLRP3-H9C2心肌细胞组(NLRP3+),SSNX干预NLRP3+组(SSNX+NLRP3+),MCC950干预NLRP3+组(MCC950+NLRP3+);CCK-8法检测细胞活性,透射电镜观察细胞形态，多因子检测细胞上清炎性因子IL-18、IL-1β含量，免疫荧光法检测细胞ASC、NLRP3双染和NLRP3、GSDMD双染蛋白表达，蛋白质免疫印迹法检测大鼠心肌组织ASC、NLRP3、Pro-Caspase-1、Caspase-1、GSDMD、GSDMD-N蛋白表达。<br>　　结果：<br>　　1.SSNX对急性心肌缺血再灌注损伤大鼠具有显著的保护作用。<br>　　SSNX能改善MIRI大鼠舌像紫暗程度，增加脉搏幅度，升高大鼠心脏射血分数，缩短心肌血流灌注达峰时间，减轻心肌组织水肿，延长活化部分凝血活酶时间，降低血清心肌酶CK、CK-MB、LDH、AST和ALT含量，改善大鼠心肌组织超微结构，减少心肌梗死面积和无复流面积。<br>　　2.SSNX可通过调节TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路发挥对急性MIRI的抗炎作用。<br>　　SSNX能减少急性MIRI大鼠心肌促炎因子IL-6、TNF-α、MCP-1的含量,减少促炎蛋白TLR4、NF-κB、p-NF-κB、NLRP3、IL-1β的表达，减轻炎症反应,保护心肌。<br>　　3.SSNX通过NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路调节NLRP3介导的细胞焦亡和炎症反应发挥对MIRI的保护作用。<br>　　SSNX可以减轻MIRI损伤大鼠心肌组织水肿，降低细胞焦亡相关通路NLRP3、ASC、Pro-Caspase-1、Caspase-1、GSDMD-N等蛋白表达水平，减少IL-1β、IL-18等炎症因子的释放，从而减轻炎症反应，保护心肌组织。<br>　　同时，在H9C2心肌细胞中过表达NLRP3时，NLRP3、ASC、Pro-Caspase-1、Caspase-1蛋白表达升高，细胞焦亡相关蛋白GSDMD、GSDMD-N表达升高，透射电镜下心肌细胞超微结构呈焦亡形态，受损细胞增多，IL-18、IL-1β释放增加，细胞炎症反应加重;SSNX能降低OGD/R损伤的H9C2细胞和NLRP3-H9C2细胞中NLRP3、ASC、Pro-Caspase-1、Caspase-1、GSDMD-N等蛋白表达水平，减少IL-1β、IL-18等炎症因子的释放，减轻细胞形态和结构的损伤程度，保护心肌细胞，保护作用效果与NLRP3抑制剂MCC950相似。<br>　　结论：<br>　　1.SSNX能改善急性MIRI大鼠心功能，增加冠脉血流,减轻心肌病理损伤，改善凝血功能，降低心肌酶水平，改善大鼠心肌超微结构，减少心肌梗死面积和无复流面积，从而保护心肌。<br>　　2.SSNX可调节TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路，降低炎症因子含量和炎症相关蛋白表达，发挥对急性MIRI的抗炎作用。<br>　　3.SSNX可调节NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路，减少炎症因子含量,降低炎症相关蛋白和焦亡相关蛋白表达，减轻炎症反应，减少细胞焦亡，从而发挥对急性MIRI和OGD/R损伤的H9C2心肌细胞的保护作用。<br>　　4.SSNX可调控cAMP/PKA/NLRP3信号通路，增加ATP含量，激活cAMP信号传递，激活PKA,促使NLRP3的Ser295磷酸化，从而抑制NLRP3炎症小体的激活，降低炎症相关蛋白表达，减少炎症因子含量，从而发挥对急性MIRI大鼠心肌和OGD/R损伤的H9C2心肌细胞的抗炎作用。<br>　　5.SSNX可调节能量代谢物质和磷脂分子在心肌的分布，改善心肌能量代谢状态及细胞膜结构和通透性，进而调节cAMP/PKA信号通路。<br>　　6.SSNX中有18种入血成分可以靶向到心肌组织，这些成分可能对急性MIRI心肌具有重要的保护作用。<br>　　综上所述，SSNX可调节TLR4/NF-κB/NLRP3和cAMP/PKA/NLRP3通路调控NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡和炎症反应，从而发挥对急性心肌缺血再灌注损伤的保护作用。