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摘要研究目的:<br>　　1.采用双盲、单模拟随机对照临床研究，明确补肾填精中药治疗DOR相关不孕的临床疗效，证实其改善患者卵巢储备功能，提高生育力的有效性与安全性。<br>　　2.通过动物实验，阐明补肾填精中药通过调控体内Keap1-Nrf2信号通路，改善卵巢氧化损伤，抑制卵巢颗粒细胞焦亡，减少卵泡异常闭锁，从而起到改善卵巢储备功能、提高生育力的作用。<br>　　研究方法:<br>　　1.临床研究<br>　　本研究采用双盲、单模拟随机对照研究，纳入肝肾阴虚型DOR相关不孕患者68例，均于2020年12月至2022年12月就诊于中国中医科学院西苑医院，符合肝肾阴虚型DOR相关不孕症的纳排标准，并已通过伦理审查。采用SAS产生随机数字，按1∶1随机分为两组。所有患者均从月经第5天起服用枸橼酸氯米芬片50mg/次，1次/天，连服5天，月经第9天服用戊酸雌二醇片1mg/次，1次/天，连服10天。月经周期第10天监测卵泡，超声监测卵泡直径1.8cm-2.0cm,予绒毛膜促性腺激素10000U肌肉注射1次诱发排卵。在此基础上，试验组34例给予补肾填精中药颗粒（药物组成:炙龟板、熟地、菟丝子、女贞子等），对照组给予补肾填精中药颗粒安慰剂，月经第5天起服，1袋/次，2次/天，连服21天。<br>　　2.动物实验<br>　　将72只ICR小鼠按照随机数字表法分为空白组、模型组、西药组、中药组、ML385（Nrf2抑制剂）+中药组、MCC950（NLRP3抑制剂）+中药组，每组12只。除空白组外，其余5组制备DOR小鼠模型。造模成功后，空白组和模型组采用生理盐水灌胃，其余各组分别予相应药物灌胃，日1次;ML385、MCC950给药方式为腹腔注射，日1次。给药14天后安死术，取材检测。观察小鼠一般状态，记录体重，阴道涂片观察动情周期，HE染色观察子宫、卵巢组织及各级卵泡数目，ELISA法检测性激素水平AMH、INHB、FSH、LH、E2,生化检测血清ROS、MDA、SOD水平，免疫组化检测卵巢组织IL-1β、IL-18表达，Western Blot检测细胞焦亡相关蛋白NLRP3、Caspase-1、GSDMD及通路关键因子Keap1、Nrf2 的蛋白表达，RT-PCT 分别检测 NLRP3、Caspase-1、GSDMDmRNA 及 Keap1、Nrf2mRNA表达水平，透射电镜观察卵巢颗粒细胞焦亡形态。<br>　　研究结果:<br>　　1.临床研究<br>　　（1）本研究共入组肝肾阴虚DOR型患者68例，脱落3例，34试验组和31例对照组患者最终完成了研究。两组患者在年龄、病程、月经史及婚育史、性激素水平、超声指标、生育力相关评分、中医证候评分等基线资料方面无明显差异，具有可比性（P＞0.05）。<br>　　（2）激素水平:试验组治疗前后比较，AMH水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）,试验组AMH升高优于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）;两组治疗前后FSH、LH、E2未见明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）。<br>　　（3）超声指标:试验组治疗前后比较，AFC水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）,试验组AFC升高优于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。两组治疗前后卵巢基质血流阻力指数（RI）未见明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）。<br>　　（4）生育力相关评分:两组治疗前后排卵情况评分、子宫内膜形态评分、子宫内膜厚度评分、子宫内膜血流评分未见明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）。<br>　　（5）中医证候评分:两组治疗前后比较，中医证候评分均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）,试验组中医证候评分降低优于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）<br>　　（6）临床妊娠率:试验组与对照组治疗后分别是35.29％（12/34）、12.90％（4/31）,试验组优于对照组，两组差异有统计学意义（P＜0.05）<br>　　（7）综合疗效:试验组与对照组治疗后总有效率分别为70.59％、45.16％,试验组优于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。<br>　　（8）安全性指标:试验组与对照组治疗前后（血常规、尿常规、肝肾功、心电图）均未见异常。研究过程中共观察到3例轻度不良事件（对照组1例患者出现腹泻，试验组患者2例出现恶心），嘱患者调整服药方法后均好转，其余患者未见不良反应。<br>　　2.动物实验<br>　　（1）小鼠一般情况:与空白组相比，予以顺铂造模后模型组小鼠毛发枯燥,活动减少，体重下降，各组小鼠D21、D28体重与空白组相比均下降（P＜0.05）,予以中药、西药、ML385+中药、MCC950+中药干预后，小鼠体重上升。<br>　　（2）小鼠动情周期;与空白组相比，予以顺铂造模后各组小鼠出现动情周期紊乱（P＜0.05）;各组予以药物干预后，与空白组比较，模型组小鼠动情周期紊乱（P＜0.05）,中药组、西药组、MCC950+中药组均出现小鼠恢复规律动情周期（P＜0.05）;与中药组相比，西药组动情周期停滞（P＜0.05）。<br>　　（3）小鼠激素水平:与空白组相比，模型组FSH、LH水平升高（P＜0.05）,E2、AMH和INHB水平降低（P＜0.05）。与模型组相比，西药组、中药组、MCC950+中药组FSH、LH水平降低（P＜0.05）,E2、AMH和INHB水平升高（P＜0.05）;与中药组相比，ML385+中药组的INHB水平较低（P＜0.05）。<br>　　（4）小鼠性腺指数:与空白组相比，模型组子宫及卵巢指数降低（P＜0.05）,与模型组相比，中药组、西药组、MCC950+中药组子宫、卵巢指数增加（P＜0.05）,ML385+中药组子宫指数呈上升趋势（P＞0.05）;与中药组相比，西药组、MCC950+中药组子宫、卵巢指数趋势相近（P＞0.05）。<br>　　（5）小鼠子宫和卵巢组织形态、卵泡计数:空白组子宫、卵巢体积、形态正常，腺体丰富，可见不同阶段的卵泡:模型组子宫、卵巢体积萎缩，腺体单薄,原始卵泡和窦状卵泡减少，窦前卵泡增多，闭锁卵泡增多。中药组、MCC950+中药组子宫和卵巢体积、形态与空白组相似，西药组卵巢间质纤维化较重，ML385+中药组与模型组相似。性腺指数方面与组织形态学结果相符，模型组小鼠子宫、卵巢指数与空白组小鼠相比下降（P＜0.05）,予以中药、MCC950+中药、西药治疗后小鼠子宫、卵巢指数上升（P＜0.05）,ML385+中药组与模型组相似（P＞0.05）。与空白组相比，模型组原始卵泡、窦状卵泡及黄体减少（P＜0.05,P＜0.01）,闭锁卵泡增加（P＜0.05）。与模型组相比，中药组、MCC950+中药组原始卵泡、窦状卵泡和黄体增加（P＜0.05,P＜0.01）,闭锁卵泡减少（P＜0.01）;西药组原始卵泡增加（P＜0.05）;ML385+中药组与模型组原始卵泡、窦状卵泡和黄体相似，闭锁卵泡数呈减少趋势（P＞0.05）。与中药组相比，西药组黄体减少（P＜0.05）。<br>　　（6）小鼠卵巢氧化应激分子:与空白组相比，模型组ROS、MDA水平升高（P＜0.01）,SOD水平降低（P＜0.05）,经中药组、MCC950+中药组治疗后ROS、MDA水平降低（P＜0.05）,SOD水平升高（P＜0.05）;西药组SOD水平升高（P＜0.05）,ML385+中药组与模型组未见明显差异（P＞0.05）。<br>　　小鼠抗氧化应激Keap1/Nrf2信号通路:与空白组比较，模型组Keap1、Nrf2蛋白相对表达量均下降（P＜0.05）;与模型组比较，中药组、MCC950+中药组干预后Keap1、Nrf2值上升（P＜0.05）,西药组Keap1相对表达量下降（P＜0.05）,ML385+中药组与模型组无明显差异（P＞0.05）。Keap1、Nrf2 mRNA表达量与蛋白表达水平结果相符。<br>　　（7）小鼠卵巢炎症因子:IL-18、IL-1β免疫组化显示，镜下观察与空白组比较，模型组卵巢组织IL-18、IL-1β分子高表达;中药、MCC950+中药组干预后,IL-18、IL-1β表达低于模型组，西药组、ML385+中药组干预后未见明显改善。<br>　　（8）小鼠卵巢焦亡表达:与空白组比较，模型组NLRP3、Caspase-1、Gasdermin D值均升高（P＜0.05）;与模型组比较，中药组、MCC950+中药组、西药组干预后 NLRP3、Caspase-1、Gasdermin D 值下降（P＜0.01）,ML385+中药组干预后 NLRP3、Caspase-1、Gasdermin D 值有下降趋势（P＞0.05）。NLRP3、Caspase-1、Gasdermin D mRNA表达量与蛋白表达水平结果相符。<br>　　（9）小鼠卵巢透射电镜:与空白组相比，模型组小鼠部分颗粒细胞胞膜破裂，细胞器变形，可见细胞内容物溢出，经中药、MCC950+中药干预后，可见正常颗粒细胞数量增多，破裂、变形细胞数目减少;西药组干预后形态及数量改善不明显，ML385+中药组干预后与模型组无明显差异。<br>　　研究结论:<br>　　1.临床研究表明，补肾填精中药可提高肝肾阴虚型DOR相关不孕患者的临床妊娠率，调节激素水平，升高AMH、AFC,改善卵巢储备功能，缓解中医症状，且治疗前后未见严重不良反应，安全性好。<br>　　2.动物实验证实，补肾填精中药通过激活Keap1/Nrf2信号通路，减轻卵巢氧化损伤，抑制颗粒细胞焦亡，减少卵泡异常闭锁，进而起到改善卵巢储备功能,提高生育力的作用。