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摘要背景：糖尿病性黄斑水肿(DiabeticMacularEdema，DME)是糖尿病(DiabetesMellitus,DM)患者视力中重度下降的主要原因之一。视网膜Müller细胞表达水通道蛋白4(Aquaporin-4,AQP4)和内向整流钾离子通道4.1(inwardlyrectifyingpotassiumchannel4.1,Kir4.1)介导的水排出途径异常是早期糖尿病视网膜水肿和DME发生的必要条件之一，但目前中药复方改善糖尿病视网膜病变(Diabeticretinopathy，DR)相关液体排出途径机制的研究较少。前期研究表明补肾活血方能改善糖尿病动物模型视网膜水液排出，尚未从体外基于AQP4/Kir4.1藕联对视网膜Müller细胞作用和机制进行研究，补肾活血方防治DR及其并发症的作用机制尚未完全明了。<br>　　目的：采用网络药理学的方法探讨补肾活血方治疗DME的分子机制并总结分析补肾活血方防治DR的作用靶点，明确补肾活血方干预DR的整体机制，并探索补肾活血方对缺氧及晚期糖基化终产物(Advancedglycationendproducts，AGEs)干预条件下体外培养视网膜Müller细胞的作用，旨在多层次、多途径阐明补肾活血方防治DR的可能作用和机制。<br>　　方法：应用网络药理学方法分析补肾活血方作用于DME的潜在药物成分、关键作用靶点及其分子通路，从多途径多层次分析补肾活血方治疗DME的可能机制。以改良酶消化法分离培养新生7天SD大鼠原代视网膜Müller细胞，并应用HE染色法、免疫组化法(GFAP染色及GS染色)鉴定；以连二亚硫酸钠(Na2S2O4)及不同浓度AGEs分别干预视网膜Müller细胞，制备缺氧和AGEs的视网膜Müller细胞模型。将细胞模型分为正常对照组(Ctr)、正常中药干预组(M)、缺氧组(Hy)、中药干预缺氧组(Hy+M)、低、高剂量AGEs组(lAGEs)、(hAGEs)及中药干预各剂量AGEs组(lAGEs+M)、(hAGEs+M)。采用中药血清药理学方法制备补肾活血方含药血清及正常对照组血清，对各组细胞模型进行干预，采用免疫荧光双标染色法检测并量化24h、48h、72h三个时间点AQP4、Kir4.1蛋白的表达；Elisa酶联免疫吸附法检测不同时间点各组视网膜Müller细胞AQP4、Kir4.1、血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)、色素上皮衍生因子(pigmentepithelium-derivedfactor，PEDF)、白介素1β(Interleukin1β，IL-1β)蛋白的表达。<br>　　结果：(1)网络药理学分析共筛选共得到425个药物靶点，1797个DME疾病靶点，168个补肾活血方作用于DME的潜在靶点。其中，丹参酮IIB、β-谷甾醇、山柰酚、木犀草素、葛根素为补肾活血方作用于DME的关键化合物成分；AKT1、TNF、IL6、INS、TP53、VEGFA、IL-1β、CASP3、PTGS2、EGFR、PPARG、MMP9、STAT3、HIF1A为补肾活血方作用于DME的关键靶点；脂质代谢相关通路、HIF-1信号通路、糖尿病并发症中AGE-RAGE信号通路、PI3K-AKT信号通路、TNF信号通路等是补肾活血方作用于DME的关键信号通路；<br>　　(2)前期研究成果表明，缺氧和AGEs会诱导视网膜iBRB紧密连接相关蛋白Occludin、ZO-1表达减少，促进炎症相关因子IL-1β、ICAM-1表达及VEGF、PEDF表达失衡而造成iBRB渗漏；缺氧、高糖合并缺氧和糖波动会导致视网膜神经节细胞和神经节细胞Müller细胞共培养条件下Glu、Gly、LDH表达增加，GS表达减少，损伤神经节细胞和视网膜Müller细胞膜稳定性，增加神经兴奋性毒性；缺氧、高糖、AGEs、TGF-β2会造成视网膜Müller细胞LDH表达增加，Glu摄取减少，GS活性降低，HIF-1α、VEGF上调，损伤视网膜Müller细胞结构功能；补肾活血方能一定程度逆转以上多种病理因素下的各种因子表达而保护视网膜iBRB、神经节细胞及Müller细胞；<br>　　(3)缺氧条件下，免疫荧光检测显示，Hy组与Ctr组和M组在24h、48h、72h三个时间点同一时间点内各组间比较，AQP4荧光强度均增强，表达均显著增加(p＜0.05)；补肾活血方含药血清干预组(Hy+M组)能显著降低缺氧条件下24h、48hAQP4荧光表达(p＜0.05)，72h表现为增加趋势(p＞0.05)；Hy组Kir4.1免疫荧光强度较Ctr组、M组均显著降低(p＜0.05)；Hy+M组对缺氧条件下Kir4.1荧光表达整体增加，48h较Hy组比较有显著差异(p＜0.05)；与Ctr组比较，M组AQP4荧光强度在24h、48h降低，72h升高；48h时间点差异组间具有显著差异(p＜0.05)；Kir4.1在24h、48h降低，72h升高，72h组间比较具有显著差异(p＜0.05)；<br>　　(4)Elisa法检测显示，各组间同一时间点比较，Hy组与Ctr组、M组比较，AQP4、VEGF、IL-1β显著增加，Kir4.1、PEDF显著降低(p＜0.05)；Hy+M组能显著降低缺氧干预条件下AQP4、VEGF、IL-1β表达并增加Kir4.1、PEDF表达(p＜0.05)；M组与Ctr组比较，不同时间点AQP4显著降低，Kir4.1、PEDF显著增加(p＜0.05)；VEGF在72h有降低趋势(p＞0.05)；IL-1β三个时间点比较均呈降低趋势(p＞0.05)；以上各检测值本组内不同时间点比较，Hy组、Hy+M组均随着时间变化前后差异显著，有明显时间效应，而Ctr组、M组24h前后无显著改变。AQP4/Kir4.1、VEGF/PEDF随时间延长，比值显著增大。<br>　　(5)AGEs干预条件下，免疫荧光检测显示，不同剂量AGEs组与Ctr组和M组在24h、48h、72h同一时间点内各组间比较，AQP4荧光强度均增强，表达均显著增加(p＜0.05)；补肾活血方含药血清干预组(lAGEs组、hAGEs组)能降低各浓度AGEs条件下各时间点AQP4荧光表达；lAGEs组在24hKir4.1荧光强度表现为增加趋势，hAGEs组为降低趋势；48h、72h各AGEs干预组Kir4.1荧光强度均显著降低(p＜0.05)；补肾活血方含药血清组能降低对应浓度AGEs干预组AQP4荧光表达，升高24h、48h对应干预组Kir4.1荧光表达，72h时间点lAGEs+M组较lAGEs组Kir4.1增加，hAGEs+M组较hAGEs组Kir4.1荧光强度减弱。<br>　　(6)Elisa法检测显示，各组间同一时间点比较，lAGEs组、hAGEs组较Ctr组、M组AQP4、VEGF、IL-1β均显著增加，Kir4.1、PEDF均显著降低(p＜0.05)；补肾活血方含药血清干预组能降低对应AGEs干预组AQP4、VEGF、IL-1β的表达，增加Kir4.1、PEDF表达，组间差异显著(p＜0.05)；hAGEs较lAGEs比较，AQP4、VEGF、IL-1β显著增加，Kir4.1、PEDF显著降低(p＜0.05)；M组与Ctr组比较，AQP4显著降低，Kir4.1、PEDF显著升高，VEGF在24h、48h显著降低(p＜0.05)，72h有降低趋势，IL-1β三个时间点均有降低趋势(p＞0.05)。各干预组组内不同时间点比较，Ctr组、M组各检测值表达较为稳定，lAGEs组、hAGEs组、lAGEs+M组、hAGEs+M组具有明显时间效应。AQP4、VEGF、IL-1β表达随着时间延长显著增加，Kir4.1、PEDF随干预时间延长表达显著降低(p＜0.05)。AGEs干预条件下，AQP4/Kir4.1、VEGF/PEDF随培养时间延长，比值显著增大，高浓度AGEs较低浓度AGEs变化更加显著。<br>　　(7)各时间点hAGEs组对AQP4、VEGF表达的影响均强于Hy组，lAGEs对Kir4.1、PEDF表达的作用均强于Hy组，hAGEs组对IL-1β表达的作用与Hy组无显著差异。<br>　　结论：<br>　　(1)网络药理学研究发现补肾活血方治疗DME涉及广泛的生理病理过程。KEGG分析表明，补肾活血方主要通过脂质代谢相关通路、HIF-1信号通路、糖尿病并发症中AGE-RAGE信号通路等信号途径治疗DME，表明缺氧和AGEs是DME发病中的重要病理因素。<br>　　(2)AGEs浓度与视网膜Müller细胞损伤程度正相关。降低AGEs浓度是保护视网膜Müller细胞重要的方式之一。<br>　　(3)缺氧和AGEs能够促进体外培养视网膜Müller细胞AQP4、VEGF、IL-1β表达，降低Kir4.1、PEDF表达，破坏AQP4/Kir4.1藕联作用及VEGF/PEDF相对平衡，上调促炎因子IL-1β损坏视网膜Müller细胞功能，且具有显著的时间效应，早期干预对改善视网膜Müller细胞功能具有重要意义。<br>　　(4)补肾活血方可一定程度改善缺氧及不同浓度AGEs干预条件下视网膜Müller细胞AQP4/Kir4.1的失藕联及VEGF/PEDF的失平衡状态，降低促炎因子IL-1β表达，这可能是补肾活血方通过保护视网膜Müller细胞防治DME的重要机制之一。<br>　　(5)AGEs对AQP4、Kir4.1、VEGF、PEDF表达的影响均强于缺氧，对IL-1β的影响二者作用相当，提示在DR防治中应兼顾始动因素AGEs与继发缺氧病理改变。<br>　　(6)补肾活血方可能通过降低神经节细胞毒性、减轻iBRB渗漏、以及保护视网膜Müller细胞三个方面全面调节视网膜神经血管单元(NVU)功能防治DR及其相关并发症DME。