摘要目的:探讨驻景丸加减方干预形觉剥夺性近视(Formdeprivationmyopia,FDM)小鼠视网膜自噬的生物学机制,为驻景丸加减方延缓早期近视性视网膜病变提供理论依据。<br> 方法:将90只正常健康的C57BL/6小鼠随机分为阴性对照组、近视模型组以及中药干预组,每组30只。除阴性对照组外,近视模型组、中药干预组小鼠右眼FDM造模,实验周期共6周。中药干预组灌胃驻景丸加减方混悬液(浓度:54.6mg/kg/d),阴性对照组、近视模型组灌胃等量生理盐水,实验过程中观察不同时间节点(实验2周后、4周后及6周后)C57BL/6小鼠相关指标。分别于造模日、三个时间节点使用带状检影镜测量所有小鼠右眼屈光度;KN-1800动物眼部A超测量所有小鼠右眼眼轴长度。屈光度与眼轴测量完毕后,各组随机挑选10只小鼠,取所选小鼠右眼视网膜检测:免疫荧光法定位和检测视网膜小胶质细胞标志物(IBa1)活性与迁移,透射电镜观察视网膜色素上皮细胞、视杆细胞自噬情况;WesternBlot与实时荧光定量PCR(q-PCR)检测视网膜组织中CaMKKβ、AMPK、mTOR、LC3Ⅱ、P62、ATG5、ATG7、beclin1蛋白与基因表达情况。<br> 结果:1.驻景丸加减方对FDM小鼠屈光度及眼轴长度的影响:形觉剥夺可诱导小鼠屈光度显著降低(P<0.01)、眼轴长度增加。驻景丸加减方可在一定程度延缓小鼠屈光度向近视方向漂移,减缓眼轴长度增加趋势。<br> 2.驻景丸加减方对FDM小鼠视网膜小胶质细胞的影响:近视模型组IBa1集中分布于小鼠视网膜神经节细胞层(Ganglioncelllayer,GCL)、内丛状层(Innerplexiformlayer,IPL)、外丛状层(Outerplexiformlayer,OPL);阴性对照组、中药干预组IBa1主要集中分布于IPL、OPL。IBa1通过平均光密度计算结果示,与近视模型组比较,阴性对照组、中药干预组(4周:P<0.05)IBa1含量呈降低趋势。<br> 3.驻景丸加减方对FDM小鼠视网膜自噬的影响:透射电镜结果示:实验2周、4周与6周后,阴性对照视网膜结构排列整齐,细胞器结构完整;近视模型组、中药干预组视网膜色素上皮层中可见少量自噬的色素细胞,视杆细胞内可见线粒体肿胀,发生断裂、融合。WesternBlot结果示:2周、4周、6周后mTOR、ATG5、ATG7、Becline1、LC3Ⅱ蛋白表达量与阴性对照组比较,近视模型组呈增加趋势;2周、4周后mTOR、ATG5、ATG7、LC3Ⅱ、P62蛋白表达量与近视模型组比较,中药干预组呈增加趋势(2周:ATG5(P<0.05)、6周:mTOR(P<0.01)、ATG5(P<0.05))。6周后mTOR、ATG5、Becline1蛋白表达量与近视模型组比较,中药干预组呈增加趋势(mTOR(P<0.01)),ATG7、LC3Ⅱ、P62蛋白表达量与近视模型组比较,中药干预组呈降低趋势。q-PCR结果示:2周、4周、6周后mTOR、ATG5、ATG7、Becline1、LC3Ⅱ、P62基因表达与与阴性对照组比较,近视模型组呈增加趋势;2周、4周后mTOR、ATG5、ATG7、Becline1、LC3Ⅱ、P62基因表达与近视模型组比较,中药干预组呈增加趋势;6周后mTOR、ATG5、Becline1基因表达与近视模型组比较,中药干预组呈增加趋势(mTOR(P<0.01)、ATG5(P<0.05)),ATG7、LC3Ⅱ、P62基因表达与近视模型组比较,中药干预组呈减少趋势。<br> 4.驻景丸加减方对FDM小鼠视网膜CaMKKβ/AMPK信号通路的影响:WesternBlot结果示:2周、4周、6周后CaMKKβ蛋白含量与阴性对照组比较,近视模型组呈增加趋势(4周、6周:P<0.05);与近视模型组比较,中药干预组呈降低趋势(4周、6周:P<0.05);AMPK蛋白含量与阴性对照组比较,近视模型组呈增加趋势(P<0.05);与近视模型组比较,中药干预组呈增加趋势。q-PCR结果示:CaMKKβ基因表达与阴性对照组比较,近视模型组呈增加趋势;与近视模型组比较,2周中药干预组呈增加趋势,4周、6周呈降低趋势;AMPK基因表达与阴性对照组比较,近视模型组呈增加趋势;与近视模型组比较,2周、4周中药干预组呈增加趋势、6周中药干预组呈降低趋势。<br> 结论:1.通过形觉剥夺可诱导小鼠向近视方向漂移,驻景丸加减方在一定程度上具有延缓FDM小鼠向近视方向漂移与抑制FDM小鼠眼轴长度增加的作用。<br> 2.在FDM小鼠向近视漂移过程中,FDM小鼠视网膜组织中小胶质细胞发生活化与迁移、CaMKKβ/AMPK信号通路被激活、自噬机制启动。<br> 3.驻景丸加减方延缓近视发展可能与其启动自噬机制、抑制视网膜小胶质细胞活化及迁移、调节CaMKKβ/AMPK信号通路有关。<br> 4.驻景丸加减方可能对早期近视性视网膜病变有一定的缓解作用。
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