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摘要目的:中药雷公藤的代表制剂雷公藤多苷片是被世界卫生组织认定为治疗关节炎的“中国首创植物新药”。近年来，随着该品种临床应用的推广，其所导致的药源性肝损伤(Drug-induced liver injury)事件屡有报道，国家食品药品监督管理局2012年也针对相关用药安全进行了通报。然而，由于研究条件和方法所限，有关雷公藤多苷片致肝损伤的毒性机制、致毒物质和防控措施等问题至今仍不明确。为此,本课题通过开展“致肝损伤靶标关联网络挖掘-致毒成分群与作用靶标识别-‘动物-细胞’多层次实验验证”的系列研究，揭示雷公藤多苷片诱发药源性肝损伤的作用机制并辨识其核心致毒成分群，以有助于该中成药的临床合理用药，也为开发雷公藤新型减毒制剂提供研究参考。<br>　　方法:(1)雷公藤多苷片诱发药源性肝损伤的靶标关联网络挖掘<br>　　(2)利用急性肝损伤小鼠模型，考察雷公藤多苷片诱发药源性肝损伤的作用特点和分子机制<br>　　（3）构建胶原诱导关节炎小鼠的慢性肝损伤模型，考察雷公藤多苷片诱发慢性药源性肝损伤的作用特点和分子机制<br>　　（4）利用正常肝细胞模型，考察雷公藤多苷片对其致毒靶标通路的调控作用<br>　　（5）雷公藤多苷片诱发药源性肝损伤潜在致毒成分的药代动力学表征<br>　　1）利用（1）中筛选到的致毒成分群，以昆明实验小鼠为载体，采用UPLCQ-TOF/MS技术针对雷公藤多苷片潜在致毒成分群在体内代谢情况进行研究，分析其在体内的变化规律及差异。<br>　　2）利用AML12细胞，考察雷公藤甲素与其他潜在致毒成分两两配伍组合干预对肝脏的毒性作用。<br>　　3）利用筛选到的潜在致毒成分组合，以急性肝损伤实验小鼠模型为载体，分别给予雷公藤多苷片单独给药、致毒成分组合或单独成分给药，采用UPLC Q-TOF/MS技术检测潜在致毒成分在体内的暴露量，及其在肝脏内组织的分布情况。<br>　　（6）雷公藤多苷片关键致毒成分的确认<br>　　分析不同潜在致毒成分组对与急性肝毒性作用强度和作用特点。利用免疫组织化学染色，考察雷公藤甲素与潜在致毒成分群组合后对CYP450蛋白表达影响，从而阐释其诱发雷公藤甲素与致毒成分组合后导致肝毒性变化的机制。<br>　　结果:（1）雷公藤多苷片诱发药源性肝损伤的靶标关联网络挖掘:<br>　　1）根据二级质谱离子碎片及化学键断裂规律，定性检测出雷公藤多苷片49个化学成分。<br>　　2）利用TCMIPv2.0预测上述49个化学成分候选靶标基因，共计639个，同时从国内外参考文献、药物数据库（Drug Bank数据库，https://go.drugbank.com/）、疾病数据库（MalaCards v5.0,Database of gene-disease associations;DisGeNET v5.0）收集药源性肝损伤的相关基因，经去冗余整合获得941个基因。<br>　　3）根据基因-基因间相互作用信息，构建雷公藤多苷片“候选靶标-肝损伤基因”的相互作用网络。通过拓扑特征计算，筛选出76个核心网络靶标，其中包含46个雷公藤多苷片候选靶标和30个药源性肝损伤相关基因。<br>　　4)功能富集分析结果表明，雷公藤多苷片核心致毒靶标基因对应的化学成分,如雷公藤甲素等，主要参与细胞自噬等相关通路，包括:RAS signaling、MAPK signaling和mTOR signaling等通路。结合数据挖掘及国内外参考文献，本研究提出如下科学假说:雷公藤多苷片所含的致毒成分群可能通过调控Ras/Raf/MEK/ERK-mTOR交联信号通路，影响肝脏细胞自噬稳态，从而诱发药源性肝损伤。<br>　　(2)利用急性肝损伤小鼠模型，考察雷公藤多苷片诱发药源性肝损伤的作用特点和分子机制<br>　　1)与空白组对比，300 mg/kg雷公藤多苷片干预显著提高肝脑指数(P＜0.001)、血清中 ALT(TGT-300 mg/kg vs。正常组:603.70±251.80 U/L vs.33.38±2.872 U/L)和 AST(TGT-300 mg/kg vs.正常组:976.20±279.70 U/L vs.135.10±13.43 U/L,P＜0.05)水平。<br>　　2)组织病理学观察结果表明，雷公藤多苷片致急性肝损伤的病理特征主要表现为肝细胞损伤，肝组织炎症反应，胆管损伤和血管损伤4个方面，其中TGT-300 mg/kg组的肝脏损伤病理表现最为严重，可见大量扩张的毛细血管窦并伴有红细胞淤积。<br>　　3)随着雷公藤多苷片给药剂量的增加，肝组织中自噬标志物LC3Ⅱ和LC3Ⅰ蛋白表达的量的比值对比空白组显著升高(24 h,P＜0.001),而P62蛋白的表达量则显著降低(6～24h,P＜0.001)。透射电镜观察显示，雷公藤多苷片干预组的肝细胞质中自噬体和自噬溶酶体数目显著增加，且细胞自噬活性被异常激活。可见，雷公藤多苷片通过激活肝细胞内的自噬活性而导致肝损伤。<br>　　4)免疫组织化学染色结果表明，雷公藤多苷片可显著激活肝细胞内的RAS-Raf-MEK-ERK信号轴，并抑制mTOR蛋白的磷酸化。<br>　　(3)利用CIA小鼠的慢性肝损伤模型，考察雷公藤多苷片诱发慢性药源性肝损伤的作用特点和分子机制<br>　　1)临床6倍剂量的雷公藤多苷片(TGT-6X给药组)在一周内可迅速有效降低CIA实验小鼠的关节炎评分、延缓病情发展。同时该组实验小鼠血清ALT(TGT-6X vs.正常组:72.39±5.14 U/L vs.36.62±4.22 U/L,P＜0.001)和 AST(TGT-6X vs.正常组:26.33.70±2.57U/L vs.18.478±1.07 U/L,P＜0.001)水平在给药 11 天后显著升高。<br>　　2）Western Blot结果显示，TGT-6X干预可异常激活肝组织中RAS/RAF/MEK-mTOR信号轴并促进肝细胞自噬，这与急性肝损伤小鼠模型的验证结果一致。<br>　　（4）利用正常肝细胞模型，考察雷公藤多苷片对其致毒靶标通路的调控作用<br>　　1)CCK8结果表明，雷公藤多苷片5、10μg/mL诱导AML12细胞18小时后，均显著增加细胞上清中 ALT(TGT-5 μg/mL vs.空白组:17.96±1.20 U/L vs.10.96士2.35U/L,P＜0.05;TGT-10μg/mL vs.空白组:22.29±2.47U/L vs.10.96±2.35U/L,P＜0.001)和 AST(TGT-5 μg/mL vs.空白组:21.17±1.65 U/L vs.14.64±2.11 U/L,P＜0.05;TGT-10 μg/mL vs.空白组:24.61±1.52 U/L vs.14.64±2.11 U/L,P＜0.01)的水平。<br>　　2）与空白组对比，雷公藤多苷片（5、10μg/mL）单独或联合自噬诱导剂Rap处理AML12细胞18小时后，可有效促进LC3 Ⅰ向LC3 Ⅱ的转化（P＜0.05）,降低P62的蛋白表达量（P＜0.05）。值得注意的是，在转染RFP-GFP-LC3的AML12细胞中，雷公藤多苷片干预可增加指示自噬溶酶体形成的的红色荧光比例，促进从自噬小体到自噬溶酶体阶段的流通顺畅。<br>　　3）雷公藤多苷片联合RAS激动剂（ML-098）协同抑制细胞增殖率，并促进细胞自噬活性;而联合RAS抑制剂（FTS）的结果与之相反。Western Blot结果显示,雷公藤多苷片可诱导增加细胞内Raf、MEK、ERK的蛋白质磷酸化水平，并抑制mTOR的蛋白质磷酸化。<br>　　（5）雷公藤多苷片诱发药源性肝损伤潜在致毒成分的药代动力学表征<br>　　1）雷公藤多苷片所含成分的定量分析结果显示，各成分的含量从高到低排序为:雷公藤碱＞雷公藤次碱＞雷公藤红素＞雷公藤晋碱＞雷公藤甲素，其中，雷公藤甲素质量分数仅为0.0051％。<br>　　2）基于AML12细胞的致毒成分毒性筛选结果表明，雷公藤红素和雷公藤甲素对肝细胞活性抑制作用最为显著，而雷公藤晋碱、雷公藤碱和雷公藤次碱对肝细胞均未观察到毒性作用。雷公藤红素联合雷公藤甲素给药可使肝细胞活率分别下降至63％（雷公藤甲素∶雷公藤红素=1∶0.5X,P＜0.01）,50％（雷公藤公藤甲素∶雷公藤红素=1∶1X,P＜0.001）和37％（雷公藤公藤甲素∶雷公藤红素=1∶2X,P＜0.001）<br>　　3）雷公藤甲素单独给药的代谢表征为快速分布并迅速消除。<br>　　4）H&E病理结果显示，雷公藤甲素和雷公藤红素单独给药后，均可导致不同程度的肝细胞水样变性，雷公藤多苷片致肝损伤是多成分整合作用的结果，其中，雷公藤甲素和雷公藤红素可能发挥了关键的致毒作用。<br>　　（6）雷公藤红素可能通过竞争性结合CYP3A4减缓雷公藤甲素代谢从而增加肝损伤风险<br>　　结论:本研究通过整合生物分子网络与“动物-细胞”实验验证，明确了雷公藤多苷片通过调控Ras/Raf/MEK/ERK-mTOR交联信号通路，激活肝细胞自噬流，从而诱发药源性肝损伤的致毒路径;同时证实了雷公藤甲素和雷公藤红素是雷公藤多苷片的关键致毒成分，发现二者的协同致毒机制可能与雷公藤红素拮抗药物代谢酶CYP3A4、增加雷公藤甲素在肝脏中的暴露量，从而增加其诱发肝损伤的风险有关。相关研究结果丰富了雷公藤多苷片诱发药源性肝损伤的作用机制，也为进一步全面辨识相关该品种的毒性物质提供研究基础和方法学借鉴，从而有助于雷公藤类中成药的质量监管、临床合理用药及产业发展。