青蒿琥酯通过诱导AFAP1L2/SRC/FUNDC1信号轴依赖型线粒体自噬而逆转肝癌对索拉非尼的耐药性-论文-万方医学网

青蒿琥酯通过诱导AFAP1L2/SRC/FUNDC1信号轴依赖型线粒体自噬而逆转肝癌对索拉非尼的耐药性

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摘要研究目的 　　索拉非尼(Sorafenib)是使用最广泛的治疗晚期肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC,以下简称为肝癌)的一线药物。不幸的是，晚期肝癌对索拉非尼的耐药性常常限制其治疗效果。越来越多的研究表明，青蒿琥酯(Artesunate)是一种有前景的候选肝癌治疗药物。然而，青蒿琥酯能否逆转肝癌对索拉非尼的耐药性尚不清楚。因此，本研究通过整合“化学生物学探针钓靶”、“转录组表达谱数据挖掘”、“生物分子网络拓扑计算”及“临床-动物-细胞”多维度实验验证，旨在阐释肝癌对索拉非尼耐药性产生的分子机制，客观评价青蒿琥酯逆转肝癌对索拉非尼耐药的药效，并明确其作用特点和机制。 　　研究方法 　　1.“青蒿琥酯抗肝癌靶标-索拉非尼耐药相关基因-索拉非尼抗肝癌靶标”网络构建及挖掘 　　(1)通过化学生物学探针钓靶实验，鉴定青蒿琥酯抗肝癌直接作用靶标谱。 　　(2)从GEO数据库(GSE143235)中收集临床来源对索拉非尼治疗敏感(药敏)和出现耐受(耐药)的肝癌组织转录组表达谱芯片数据，通过组间差异表达数据分析，获得肝癌索拉非尼耐药相关基因集。 　　(3)采用Python爬取代码，从高质量文献及数据库中收集已知的索拉非尼抗肝癌作用靶标谱。 　　(4)利用上述药物靶标、疾病基因之间的相互作用信息，构建“青蒿琥酯抗肝癌靶标-索拉非尼耐药相关基因-索拉非尼抗肝癌靶标”互作网络，并通过网络拓扑特征计算和功能挖掘，分析青蒿琥酯逆转肝癌对索拉非尼耐药性的潜能及其作用机制。 　　2.利用临床生物样本，考察青蒿琥酯逆转肝癌索拉非尼耐药的直接作用靶点——肌动蛋白丝相关蛋白1相似蛋白2(ActinFilamentAssociatedProtein1Like2,AFAP1L2)与肝癌恶性进展和不良预后的相关性 　　(1)从中国人民解放军总医院第五医学中心收集100例肝癌患者的99个肝癌组织样本和18个癌旁非癌肝脏组织样本，均经病理学鉴定和确认。 　　(2)采用RT-qPCR检测肝癌组织及癌旁非癌肝脏组织中AFAP1L2的表达水平，并进行组间对比分析。 　　（3）利用KaplanMeier-plotter在线数据库所收录的364例肝癌临床样本转录组表达谱芯片数据，开展Kaplan-Meier生存分析和Log-rank检验分析，全面评价AFAP1L2的表达水平与肝癌患者预后的相关性。 　　3.利用肝癌索拉非尼耐药细胞株和动物模型，客观评价青蒿琥酯逆转肝癌对索拉非尼耐药性的药效和作用特点 　　（1）基于“药物梯度浓度递增法”，采用索拉非尼持续诱导HepG2细胞9个月以上，建立索拉非尼耐药细胞模型HepG2R,并通过细胞毒性、细胞增殖、细胞凋亡及Westernblot实验检测耐药细胞是否构建成功。此外，将3.5μM索拉非尼和25μM青蒿琥酯联合给药干预HepG2R细胞，并开展细胞毒性、细胞增殖、凋亡等实验评价青蒿琥酯逆转肝癌耐药细胞对索拉非尼耐药性的药效。 　　（2）采用慢病毒表达载体建立AFAP1L2稳定敲低或过表达的HepG2细胞系，并给予3.5μM索拉非尼干预处理，进而开展细胞毒性、细胞增殖、凋亡等实验，考察AFAP1L2敲低或过表达后HepG2细胞对索拉非尼耐药性的变化。进一步采用25μM青蒿琥酯处理上述细胞系，并开展相同的检测实验，考察青蒿琥酯逆转肝癌耐药细胞对索拉非尼耐药性是否依赖于抑制AFAP1L2。 　　（3）采用线粒体自噬抑制剂氯喹（Chloroquine,CQ）和青蒿琥酯同时处理肝癌耐药细胞HepG2R,开展细胞毒性、细胞增殖、凋亡等实验，考察青蒿琥酯逆转肝癌索拉非尼耐药细胞耐药性的药效，并从反向验证青蒿琥酯逆转索拉非尼耐药是否依赖于激活线粒体自噬。 　　（4）基于肝脏原位癌裸鼠模型，持续3周口服给予30mg/kg/2天的索拉非尼诱导造模，构建对索拉非尼耐药的肝脏原位癌动物模型，并采用小动物活体成像仪及MicroPET/CT、Kaplan-Meier生存分析、H&E染色、肝脑指数、肝脏大体拍照等方法，评价耐药动物模型构建是否成功。进一步，将30mg/kg/2天的索拉非尼和低剂量的青蒿琥酯（30mg/kg/2天）或高剂量的青蒿琥酯（60mg/kg/2天）联合给药干预索拉非尼耐药动物，同样采用上述小动物活体成像仪及MicroPET/CT等方法，考察青蒿琥酯逆转肝癌耐药动物对索拉非尼耐药性的药效。 　　（5）基于对索拉非尼药敏的肝脏原位癌动物模型，采用与上述耐药动物模型相同的给药分组、给药剂量和检测方法，考察青蒿琥酯能否增强索拉非尼对药敏动物肿瘤的抑制作用。 　　4.利用肝癌索拉非尼耐药细胞株和动物模型，验证青蒿琥酯逆转肝癌对索拉非尼耐药性的作用靶点和机制 　　(1)基于索拉非尼耐药细胞模型HepG2R,采用Westernblot、免疫荧光双染及CO-IP(co-inmunoprecipitation)等方法，检测AFAP1L2/SRC(SRCProto-Oncogene,Non-ReceptorTyrosineKinase)/FUNDC1(FUN14DomainContaining1)信号轴和线粒体自噬在肝癌索拉非尼耐药细胞中的调控作用方式和活性变化趋势。此外，将3.5μM索拉非尼与25μM的青蒿琥酯联合给药处理HepG2R,采用Westernblot、免疫荧光双染、Pulldown-wb、细胞热转移(CellularThermalShiftAssay,CETSA)、表面等离子共振(SurfacePlasmonResonance,SPR)等实验，检测青蒿琥酯对耐药细胞中AFAP1L2/SRC/FUNDC1信号轴和线粒体自噬的调控作用，明确青蒿琥酯逆转肝癌对索拉非尼耐药性的作用靶点和机制。 　　(2)基于AFAP1L2稳定敲低或过表达的HepG2细胞系，并给予3.5μM索拉非尼处理，采用Westernblot、免疫荧光双染检测AFAP1L2敲低或过表达后HepG2细胞内AFAP1L2/SRC/FUNDC1信号轴和线粒体自噬的变化。进而采用25μM的青蒿琥酯干预处理上述细胞系，同样采用Westernblot、免疫荧光双染等方法，检测青蒿琥酯对AFAP1L2/SRC/FUNDC1信号轴和线粒体自噬的调控作用，反向验证青蒿琥酯逆转索拉非尼耐药是否依赖于调控AFAP1L2。 　　(3)基于对索拉非尼耐药的肝脏原位癌动物模型，采用Westernblot、免疫组织化学、透射电镜等检测AFAP1L2/SRC/FUNDC1信号轴和线粒体自噬在肝癌索拉非尼耐药动物中的调控作用方式和活性变化趋势。进一步，将30mg/kg/2天的索拉非尼和低剂量的青蒿琥酯(30mg/kg/2天)或高剂量的青蒿琥酯(60mg/kg/2天)联合给药干预索拉非尼耐药动物，同样采用上述检测方法检测青蒿琥酯对AFAP1L2/SRC/FUNDC1信号轴和线粒体自噬的调控作用，明确青蒿琥酯逆转肝癌对索拉非尼耐药性的作用靶点和机制。 　　(4)基于对索拉非尼药敏的肝脏原位癌动物模型，采用与上述耐药动物模型相同的给药分组、给药剂量和检测方法，检测AFAP1L2/SRC/FUNDC1信号轴和线粒体自噬在肝癌索拉非尼药敏动物中的调控作用方式和活性变化趋势，以及索拉非尼联合青蒿琥酯干预药敏动物后，上述信号轴和线粒体自噬的改变,以明确青蒿琥酯增强索拉非尼抑制肝癌的作用靶点和机制。 　　研究结果 　　1.青蒿琥酯可能通过靶向调控AFAP1L2/SRC/FUNDC1信号轴以及线粒体自噬来干预索拉非尼耐药 　　(1)通过化学生物学探针钓靶实验，共鉴定出青蒿琥酯抗肝癌直接作用靶标蛋白质58个;通过临床转录组学数据挖掘，共获得肝癌索拉非尼耐药相关基因141个;从高质量文献及数据库中，共收集到已知索拉非尼抗肝癌作用靶标蛋白质53个;将上述药物靶标蛋白质的ID均转换为其编码基因的OfficialGeneSymbol,便于后续整合分析。 　　(2)通过构建“青蒿琥酯抗肝癌靶标-索拉非尼耐药相关基因-索拉非尼抗肝癌靶标”互作网络及网络拓扑特征计算和功能挖掘，发现青蒿琥酯可能通过调控其直接靶标AFAP1L2,干预索拉非尼作用靶标SRC及其下游的线粒体自噬激活关键蛋白FUNDC1,进而影响线粒体自噬环节，并发挥其逆转肝癌索拉非尼耐药性的作用。 　　2.AFAP1L2与肝癌患者恶性进展和不良预后密切相关 　　(1)经组间对比分析结果表明，AFAP1L2在肝癌组织中的基因表达量明显高于癌旁非癌肝脏组织（p＜0.05）。 　　(2)根据Kaplan-Meier生存分析和Log-rank检验分析，结果发现，AFAP1L2高表达的肝癌患者，其总体生存期显著短于AFAP1L2低表达的肝癌患者，即AFAP1L2的高表达预示着肝癌患者的不良预后(p＜0.05)。 　　3.青蒿琥酯可逆转肝癌耐药细胞和耐药动物对索拉非尼的耐药性 　　(1)肝癌细胞经过索拉非尼持续诱导后，其对索拉非尼的IC50明显提高,增殖能力明显增强，凋亡率明显降低，细胞多药耐药相关标志基因的表达量明显提高，说明索拉非尼耐药细胞构建成功。进一步，采用3.5μM索拉非尼和12.5μM、25μM及50μM剂量的青蒿琥酯联合给药干预索拉非尼耐药细胞后,发现青蒿琥酯可以剂量依赖性地抑制耐药细胞的增殖活性、诱导耐药细胞凋亡,并逆转耐药细胞对索拉非尼的耐药性。 　　(2)肝癌细胞HepG2稳定过表达AFAP1L2后，其对索拉非尼的IC50明显提高，细胞增殖能力明显增强，凋亡率明显降低，均与敲低AFAP1L2的肝癌细胞表征相反，说明AFAP1L2高表达可诱导肝癌细胞对索拉非尼的耐药性。进一步，采用青蒿琥酯干预处理上述细胞后，发现青蒿琥酯对过表达AFAP1L2的HepG2细胞增殖活性及其凋亡的影响均明显减弱，说明青蒿琥酯逆转索拉非尼耐药依赖于抑制AFAP1L2。 　　（3）采用线粒体自噬抑制剂氯喹和青蒿琥酯同时处理肝癌耐药细胞，发现氯喹明显减弱了青蒿琥酯激活的线粒体自噬，并降低了青蒿琥酯对耐药细胞增殖的抑制和凋亡的诱导作用，说明青蒿琥酯逆转索拉非尼耐药依赖于激活肝癌细胞的线粒体自噬。 　　（4）肝癌模型组和索拉非尼耐药组动物的肝脏肿瘤持续增长，索拉非尼药敏组动物肝脏肿瘤持续减少或不变;H&E染色结果表明，肝癌组和耐药组动物肝脏组织中出现肿瘤灶、坏死区域、空泡样细胞以及炎性浸润，药敏组则明显减轻;肝脑指数结果表明，药敏组动物肝脑指数明显小于肝癌组，耐药组动物肝脑指数明显大于药敏组，并接近肝癌组甚至大于肝癌组;肝脏大体照片也显示耐药组动物肝脏组织上出现大量的肿瘤及结节;上述结果表明，索拉非尼耐药动物模型构建成功。 　　（5）索拉非尼与低、高剂量青蒿琥酯联合干预均可有效抑制索拉非尼耐药裸鼠肿瘤的生长，并显著延长了耐药组裸鼠的总体生存期(p＜0.05）;从病理层面的观察结果表明，耐药动物经索拉非尼和低、高剂量青蒿琥酯组合干预后，肝脏组织肿瘤灶明显缩小，坏死区域及空泡样细胞明显减少，炎性浸润明显减轻;由肝脑指数和肝脏大体照片结果可知，索拉非尼和低、高剂量青蒿琥酯组合干预可显著减少耐药动物肝脏的肿瘤数量和肝脑比值（p＜0.05）。 　　（6）索拉非尼与低、高剂量青蒿琥酯联合干预索拉非尼药敏的肝癌动物模型，其肿瘤生长状态、总体生存期、组织病理学改变、肿瘤数量及肝脑比值的变化趋势均与（5）相同，说明青蒿琥酯除了可以显著增强索拉非尼对耐药组织的抑制作用，也可以显著增强索拉非尼对药敏组织的抑制作用（p＜0.05）。 　　4.青蒿琥酯逆转肝癌耐药细胞及耐药动物对索拉非尼的耐药性与其靶向调控AFAP1L2/SRC/FUNDC1信号轴介导的线粒体自噬环节密切相关 　　(1)Westernblot和免疫荧光双染结果表明，索拉非尼耐药细胞中AFAP1L2/SRC/FUNDC1信号轴高表达，且线粒体自噬被抑制。此外，CO-IP结果表明，AFAP1L2可直接结合SRC。采用索拉非尼与不同剂量的青蒿琥酯联合给药处理耐药细胞，青蒿琥酯可以剂量依赖性地抑制耐药细胞中AFAP1L2/SRC/FUNDC1信号轴，同时过度激活被抑制的线粒体自噬。此外，Pulldown-wb、细胞热转移、表面等离子共振等实验结果表明，青蒿琥酯可直接抑制AFAP1L2蛋白表达。 　　(2)基于AFAP1L2稳定敲低或过表达HepG2细胞系的实验结果表明，将AFAP1L2敲低或过表达后，AFAP1L2下游分子SRC和FUNDC1的表达水平明显降低或升高，且线粒体自噬水平呈现相反的趋势。进一步采用青蒿琥酯干预上述细胞系，青蒿琥酯对AFAP1L2/SRC/FUNDC1信号轴的抑制作用和对线粒体自噬的诱导作用明显减弱，上述结果表明青蒿琥酯对SRC/FUNDC1信号轴和线粒体自噬的调控作用均依赖于AFAP1L2。 　　(3)基于索拉非尼耐药动物模型的实验结果表明，耐药动物的AFAP1L2/SRC/FUNDC1信号轴被显著上调，而线粒体自噬则被显著抑制，与基于耐药细胞模型结果一致(p＜0.05)。采用索拉非尼与低、高剂量青蒿琥酯联合给药干预耐药动物，青蒿琥酯剂量依赖性地抑制耐药组织AFAP1L2/SRC/FUNDC1信号轴成员分子的表达水平,并显著增强其线粒体自噬水平，可见，青蒿琥酯可以显著抑制耐药动物中AFAP1L2/SRC/FUNDC1信号轴，且过度激活被抑制的线粒体自噬（p＜0.05）。 　　(4)基于索拉非尼药敏动物模型的实验结果表明，索拉非尼与低、高剂量青蒿琥酯联合干预药敏动物后，青蒿琥酯同样剂量依赖性地抑制药敏组织中AFAP1L2/SRC/FUNDC1信号轴成员分子的表达水平，并显著增强其线粒体自噬水平，可见，青蒿琥酯除了可以显著抑制耐药动物AFAP1L2/SRC/FUNDC1信号轴的活性，且过度激活被抑制的线粒体自噬(p＜0.05),还可以抑制药敏动物AFAP1L2/SRC/FUNDC1信号轴，且过度激活线粒体自噬。 　　研究结论 　　肝癌细胞对索拉非尼耐药性的产生与AFAP1L2/SRC/FUNDC1信号轴所介导的线粒体自噬途径抑制密切相关。青蒿琥酯通过干预AFAP1L2/SRC/FUNDC1信号轴，过度激活耐药细胞的线粒体自噬，并诱导其凋亡，从而发挥其逆转肝癌对索拉非尼的耐药性。