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摘要研究目的<br>　　本课题组前期动物实验研究结果显示，卵巢切除（OVX）大鼠的Hedgehog通路关键因子Ihh、Smo、Ptch和GLi-1的mRNA及其蛋白表达水平明显增高,RANKL/OPG比值增高，OC活性异常增强，骨量减少。左归丸可使上述Hedgehog通路关键因子明显降低，并可增加OVX大鼠骨密度，改善骨小梁微观形态，对OVX大鼠骨质疏松症有明显的治疗作用。在此基础上，本研究建立成骨细胞、破骨细胞和骨磨片共同培养体系，进一步从Hedgehog-GLi通路的角度，探讨左归丸含药血清对破骨细胞骨吸收功能的影响，以进一步揭示左归丸治疗绝经后骨质疏松症的机制，为中医治疗该病提供进一步的实验依据。<br>　　研究方法<br>　　本研究分以下2个实验进行:<br>　　实验一左归丸含药血清对破骨细胞数量及功能的影响<br>　　建立成骨细胞、破骨细胞和骨磨片共同培养体系，制备各组大鼠含药血清。实验分组如下:①空白对照组:共培养体系+空白对照组大鼠血清;②假手术组:共培养体系+假手术组大鼠血清;③OVX组:共培养体系+OVX组大鼠血清;④阳性对照组:共培养体系+E组大鼠血清;⑤高剂量左归丸组:共培养体系+高剂量左归丸含药大鼠血清（15％含药血清）;⑥中剂量左归丸组:共培养体系+中剂量左归丸含药大鼠血清（10％含药血清）;⑦低剂量左归丸组:共培养体系+低剂量左归丸含药大鼠血清（5％含药血清）。于共培养24h细胞贴壁后，更换为各组大鼠血清的培养液，共培养7d后，收集细胞进行后续实验。对破骨细胞进行TRAP染色，观察并计算TRAP+细胞数，使用甲苯胺蓝对骨片吸收陷窝进行染色，计算骨吸收陷窝面积百分比。<br>　　实验二左归丸含药血清对Hedgehog-GLi信号通路的影响<br>　　本实验分组如下:①空白对照组:共培养体系+空白对照组大鼠血清;②假手术组:共培养体系+假手术组大鼠血清;③OVX组:共培养体系+OVX组大鼠血清;④阳性对照组:共培养体系+E组大鼠血清;⑤左归丸组:共培养体系+10％左归丸含药大鼠血清;⑥激动剂组:共培养体系+N-Shh（Hedgehog-GLi信号通路激动剂)+OVX组大鼠血清;⑦激动剂+左归丸组:共培养体系+N-Shh+10％左归丸含药大鼠血清。<br>　　对分化的破骨细胞进行TRAP染色，观察并计算TRAP+细胞数;对骨磨片进行甲苯胺蓝染色并观察骨陷窝形态计算骨吸收陷窝面积百分比;采用ELISA法检测共培养体系上清液中TRAP的含量;采用Real-timePCR方法检测成骨细胞Ihh、Ptch、Smo、GLi1、OPG及RANKL的mRNA表达;采用免疫荧光方法，检测成骨细胞Ihh、Ptch、Smo及GLi1的蛋白表达;采用免疫组化方法，检测成骨细胞OPG、RANKL的蛋白表达。<br>　　研究结果<br>　　(1)OVX组较假手术组TRAP+细胞个数及骨吸收陷窝面积均显著增加，与OVX组相比，左归丸中剂量、高剂量含药血清组TRAP+细胞个数及骨吸收陷窝面积显著下降，中剂量(10％)与高剂量(15％)左归丸含药血清作用效果无明显差异，低剂量(5％)无效。故采用10％左归丸含药血清进行后续实验。<br>　　(2)OVX组较假手术组TRAP+细胞个数及骨吸收陷窝面积均显著增加，细胞上清液中TRAP含量明显增高;与OVX组相比，阳性对照组和左归丸组的TRAP+细胞个数及骨吸收陷窝面积显著下降，且细胞上清液中TRAP含量明显降低。OVX组Ihh、Ptch、Smo及GLi1的mRNA及蛋白表达，较假手术组显著上调;且相较于假手术组，OVX组成骨细胞中OPGmRNA和蛋白表达水平显著降低，RANKLmRNA和蛋白表达水平显著增加，RANKL/OPG比值明显增高。而给予含有雌激素和左归丸的药物血清后，与OVX组相比，阳性对照组与左归丸组Ihh、Ptch、Smo及GLi1的mRNA及蛋白表达明显下调;且OPGmRNA和蛋白表达水平显著升高，RANKLmRNA和蛋白表达水平显著降低，RANKL/OPG比值明显下降。OVX组加入激动剂Shh重组蛋白后，Hedgehog-GLi信号通路关键因子mRNA及蛋白的表达较OVX组明显增加。与激动剂组比较，激动剂+左归丸组Ihh、Ptch、Smo及GLi1的mRNA和蛋白表达以及RANKL/OPG比值均明显下降。<br>　　以上各指标，假手术组与空白对照组相比均无统计学差异，从而排除了手术因素对实验结果的影响。<br>　　研究结论<br>　　OVX大鼠血清可使成骨细胞Hedgehog通路关键因子Ihh、Ptch、Smo和GLi1的mRNA及其蛋白表达显著上调，使RANKL/OPG比值显著增加;同时,可明显使破骨细胞数量增加、活性增强，从而导致其骨吸收功能明显增强。而左归丸含药血清可在一定程度上使以上指标发生逆转。结合课题组前期体内实验研究结果，表明左归丸可通过抑制Hedgehog通路活性而使破骨细胞骨吸收功能减弱，进而达到治疗绝经后骨质疏松症的作用。