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摘要背景及目的：<br>　　视神经脊髓炎(Neuromyelitis optica,NMO)是一种主要累及中枢神经系统的自身免疫性炎症性脱髓鞘疾病，临床特征为反复发作的急性视神经炎和脊髓炎。NMO在很长的一段时期被人们认为是多发性硬化(Multiple sclerosis,MS)的一种特殊类型，直至其致病性水通道蛋白4相关抗体的发现，两者才得以区分。与MS相比，NMO患者更容易出现严重的神经系统功能障碍、重度视神经炎、无继发性进展，以及更差的临床结局。在NMO的发病机制中，体液免疫发挥主要作用，然而最近的研究证明，滤泡辅助性T细胞(Follicular helper T cells,Tfh)通过促进生发中心形成，帮助B细胞分化、增殖和产生高亲和力抗体在NMO的发病机制中也发挥了重要作用。Roquin是一种RNA结合蛋白，可以在转录后负调节促炎信使RNA,通过诱导靶mRNA的降解或翻译沉默防止T细胞自发性活化和分化，在维持免疫耐受和稳态中发挥重要作用。有研究证明Roquin可以通过抑制Akt-mTOR通路信号传导抑制mTOR激酶的活性，从而抑制Tfh细胞的分化，但是其具体作用机制以及与NMO发病之间的关系还需要进一步研究。近年来，越来越多的研究强调了代谢重编程对各种免疫细胞分化和功能的重要影响，已有研究证明了 mTOR依赖的糖酵解对Tfh细胞分化具有促进作用，因此我们推测Roquin可能通过mTOR-糖酵解途径调控Tfh细胞的分化并参与NMO的发病。本研究通过检测NMO患者和健康人外周血中Tfh细胞的比例和CD4+T细胞中Roquin的表达水平初步探究Roquin和Tfh细胞与NMO发病之间的关系，并且通过电转染小干扰RNA构建Roquin缺陷naive CD4+T细胞，进一步探寻Roquin发挥其生物学作用的机制，为NMO的发病机制的研究和寻找新的免疫治疗方法提供新的思路。<br>　　方法：<br>　　1.收集20例血清AQP4抗体阳性NMO患者和20例健康志愿者的外周血并分离出单个核细胞，使用流式细胞术测定并比较两组外周血单个核细胞中Tfh细胞所占比例。<br>　　2.免疫磁珠分选法分选出健康对照组和NMO疾病组外周血单个核细胞中的CD4+T细胞,使用qPCR检测并比较两组CD4+T细胞中Roquin的mRNA表达水平。<br>　　3.免疫磁珠分选法分选健康人外周血单个核细胞中的naive CD4+T细胞并分为四组:对照组、转染组(转染si-Roquin敲减Roquin的表达)、转染+雷帕霉素(rapamycin,mTOR抑制剂)组、转染+2-脱氧葡萄糖(2-DG,糖酵解抑制剂)组，在Tfh细胞极化的条件下培养。<br>　　4.使用qPCR检测对照组和转染组细胞中Roquin的mRNA表达水平，以证实转染效果。使用Western Blot检测各组细胞中p-Akt、p-mTOR、Hif-1α以及糖酵解关键蛋白GLUT1、HK2、PKM2的表达水平，使用葡萄糖检测试剂盒检测各组细胞葡萄糖摄取量。使用流式细胞术测定并比较各组细胞中Tfh细胞的分化比例。<br>　　结果：<br>　　1.流式细胞术测定结果显示，健康对照组和NMO疾病组外周血单个核细胞中CD3+CD4+CXCR5+PD-1+Tfh 细胞比例分别为(1.295±0.113)％、(3.037±0.200)％。与健康对照组相比，NMO疾病组外周血单个核细胞中Tfh细胞比例升高(P＜0.001)。<br>　　2.qPCR结果显示，健康对照组和NMO疾病组外周血CD4+T细胞中Roquin的mRNA相对表达量分别为1.033±0.060、0.786±0.043,与健康对照组相比,NMO疾病组外周血CD4+T细胞中Roquin的表达水平降低(P＜0.01)。<br>　　3.qPCR结果显示，对照组和转染组细胞中Roquin的mRNA相对表达量分别为1.010±0.0108、0.617±0.030,转染组细胞中Roquin的mRNA相对表达水平显著低于对照组(P＜0.05),证实转染成功。<br>　　4.Western Blot和试剂盒检测结果显示，与对照组相比，转染组细胞中p-Akt、p-mTOR、HIF-1α以及糖酵解相关蛋白GLUT1、HK2、PKM2的表达水平升高，葡萄糖摄取量升高，差异均具有统计学意义;与转染组相比，转染+雷帕霉素组细胞中p-Akt的表达水平无明显差异，p-mTOR、HIF-1α以及糖酵解相关蛋白GLUT1、HK2、PKM2的表达水平降低，葡萄糖摄取量降低，差异均具有统计学意义;与转染组相比，转染+2-DG组细胞中p-Akt、p-mTOR Hif-1α的表达水平无明显差异，糖酵解相关蛋白GLUT1、HK2、PKM2的表达水平降低，葡萄糖摄取量降低，差异均具有统计学意义。<br>　　5.流式细胞术测定结果显示，对照组、转染组、转染+雷帕霉素组、转染+2-DG组体外培养后Tfh细胞分化比例分别为（5.09±0.447）％、（8.443±0.759）％、（4.553±0.622）％、（4.647±0、716）％,与对照组相比，转染组 Tfh细胞分化比例升高（P＜0.01）;而与转染组相比，转染+雷帕霉素组和转染+2-DG组Tfh细胞分化比例均降低（均P＜0.001）,且两组间无明显差异（P＞0.05）。<br>　　结论：<br>　　1.NMO患者外周血单个核细胞中Tfh细胞比例升高，CD4+T细胞中Roquin的表达水平降低，Roquin蛋白和Tfh细胞可能参与NMO疾病的发生和发展。<br>　　2.Roquin蛋白可以通过抑制mTOR相关通路活性和糖酵解水平抑制Tfh细胞的分化，并可能通过这一调节机制的失衡参与NMO疾病。