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摘要研究背景和目的:<br>　　视神经脊髓炎(Neuromyelitisoptica,NMO)是一种体液免疫紊乱介导的、细胞免疫广泛参与的中枢神经系统脱髓鞘疾病，以视神经和脊髓受累为主。T滤泡辅助细胞(FollicularhelperTcells,Tfh)是CD4+T细胞亚群中的一种，在体液免疫中发挥着辅助作用。Tfh细胞与B细胞相互作用，通过直接接触或分泌白介素-21(Interleukin-21,IL-21)等细胞因子，促进B细胞活化、增殖、分化成浆细胞，合成并分泌抗体，促进生发中心(Germinalcenter,GC)的形成。幼稚B(Na?veB)细胞指没有遇到抗原的B细胞，记忆B细胞是由在Tfh细胞帮助下完成亲和力饱和与亚型转化的B细胞分化而来，一旦遇到抗原，便能迅速发生生发中心反应，大量增殖并分泌免疫球蛋白，按照免疫球蛋白亚型不同，记忆B细胞主要可以分为IgG+和IgM+两种，IgG+记忆B细胞称为类型转换的记忆B(SwitchedmemoryB,SMB)细胞，再次遭遇抗原后能大量增殖，分化为浆细胞。IL-21由活化的CD4+T细胞产生，可显著影响B细胞的增殖、存活、分化和免疫球蛋白反应，IL-21可以在共刺激性T细胞信号的情况下刺激B细胞增殖和分化。白介素-6(Interleukin-6,IL-6)是一种重要的促炎因子，可通过促进浆母细胞存活、刺激水通道蛋白-4(Anti-aquaporin-4,AQP4)抗体分泌、降低血脑屏障功能完整性以及增强促炎性T淋巴细胞分化和活化，参与视神经脊髓炎的发病，把IL-6受体作为靶点的预防视神经脊髓炎复发的临床研究显示IL-6靶向治疗能降低疾病复发率。<br>　　Roquin蛋白是新的泛素连接酶家族中的一员，作为RNA结合蛋白可以通过调节某些信使RNA(MessengerRNA,mRNA)的表达，控制T细胞的激活和分化，从而参与人体内免疫耐受机制，并阻止针对人体自身结构的免疫反应。Roquin的一些mRNA靶标包括ICOS、IL-6、OX40和肿瘤坏死因子(Tumornecrosisfactor,TNF)等。具有Roquin突变的小鼠表现出高ICOS表达、生成过多的Tfh细胞并有狼疮样病变。Roquin调控Tfh细胞的分化，控制Tfh细胞的积累，进而影响依赖Tfh细胞帮助的体液免疫。<br>　　因此，本研究通过检测NMO患者外周血中Roquin表达水平、Tfh细胞比例、B细胞亚群比例、外周血清IL-6和IL-21的水平，分析临床扩展致残量表评分(Expandeddisabilitystatusscale,EDSS)与上述指标的相关性、Roquin表达水平与Tfh细胞比例的相关性，探讨Roquin对视神经脊髓炎疾病的影响，并在体外细胞水平上建立Roquin抑制na?veCD4+T细胞，诱导分化为Tfh细胞后，进行T-B细胞共培养，从而验证Roquin对Tfh细胞分化及T-B细胞相互作用的调控，为探索新的治疗方法奠定基础。<br>　　方法:<br>　　收集2022年3月至2023年1月于郑州大学第一附属医院神经内科收治的NMO患者29例，其中急性期15例,缓解期14例，同期健康对照(Healthycontrol,HC)组患者15例，所有入组患者均经过我院2名及以上神经内科医生详细的问诊和神经系统专科查体，并完善各项必要的检查与检验。采用免疫磁珠分选、实时荧光定量PCR(Quantitativereal-timePCR,RT-qPCR)检测外周血CD4+T细胞Roquin表达水平，流式细胞术测定NMO组和HC组外周血Tfh细胞、B细胞亚群的比例，酶联免疫吸附法(Enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)检测血清IL-6、IL-21的水平，分析EDSS评分与上述指标的相关性;体外转染小干扰RNA(SmallinterferingRNA,siRNA)至na?veCD4+T细胞中抑制Roquin的表达,向Tfh细胞方向诱导分化后与B细胞共培养进行机制方面的验证。SPSS26.0统计软件用于数据分析，P＜0.05,认为差异有统计学意义。流式数据的结果运用FlowJo软件分析，统计图表采用GraphPadPrism9.0制作。分析Tfh细胞、类型转换的记忆B细胞、幼稚B细胞及Roquin、IL-6、IL-21在NMO组和健康对照组中的表达差异以及与临床指标的相关性。<br>　　结果:<br>　　1.NMO及HC组CD4+T细胞的Roquin表达水平<br>　　NMO组、HC组的Roquin相对表达量分别为:0.79±0.04、1.07±0.13,NMO组较HC组Roquin表达量偏低，差异有统计学意义(P=0.038);NMO组急性期、缓解期、HC组分别对比(0.76±0.06比0.83±0.06比1.07±0.13),Roquin表达量急性期稍低于缓解期、低于HC,但差异无统计学意义(P＞0.05)。<br>　　2.NMO组急性期、缓解期及HC组外周血Tfh细胞的比例及Roquin表达水平与Tfh细胞比例的相关性<br>　　NMO急性期、缓解期、HC组的外周血Tfh细胞比例分别为:(2.70±0.19)％、(2.02±0.09)％、(1.16±0.07)％,急性期和缓解期Tfh细胞比例明显高于HC组(均P＜0.0001),且与缓解期相比，NMO急性期Tfh细胞比例也升高，差异有统计学意义(P=0.012);Roquin表达量与Tfh细胞比例之间呈负相关，相关系数r=-0.442,差异有统计学意义(P=0.003)。<br>　　3.NMO组急性期、缓解期及HC组外周血B细胞亚群的比例<br>　　NMO急性期、缓解期、HC组的类型转换的记忆B(SMB)细胞亚群(CD19+CD27+IgD-)的比例分别为:(21.63±1.82)％、(14.63±1.26)％、(9.26±1.16)％,急性期大于缓解期大于HC,差异有统计学意义(均P＜0.05);各组幼稚B(na?veB)细胞亚群(CD19+IgD+CD27-)的比例分别为:(49.85±4.15)％、(53.03±3.86)％、(68.99±4.42)％,急性期小于HC,差异有统计学意义(P=0.002),缓解期小于HC,差异有统计学意义(P=0.006),但急性期和缓解期之间差异不明显(P=0.922)。<br>　　4.NMO组急性期、缓解期及HC组外周血IL-6、IL-21的浓度<br>　　NMO急性期、缓解期、HC组外周血IL-6的浓度分别为:(7.25±0.70)pg/mL、(4.99±0.12)pg/mL、(3.66±0.10)pg/mL,三组间差异具有统计学意义(均P＜0.05);三组外周血IL-21的浓度分别为:(13.96±1.67)pg/mL、(5.36±0.37)pg/mL、(3.90±0.24)pg/mL,三组间差异具有统计学意义(均P＜0.05);NMO患者血清中IL-6、IL-21水平大于健康对照组，且急性期高于缓解期。<br>　　5.Roquin表达水平、Tfh细胞比例、SMB细胞比例、na?veB细胞比例、IL-6浓度、IL-21浓度与EDSS评分的相关性<br>　　Roquin相对表达量与EDSS评分呈负相关，相关系数为-0.504,差异有统计学意义(P=0.005);Tfh细胞比例、SMB细胞比例、IL-6浓度、IL-21浓度与EDSS评分呈正相关，相关系数分别为0.467、0.716、0.616、0.460,差异有统计学意义(均P＜0.05);na?veB细胞比例与EDSS呈负相关趋势，但相关系数较低(r=-0.224),差异无统计学意义(P=0.243)。<br>　　6.未转染组与转染si-RNA组诱导分化的Tfh细胞比例<br>　　未转染组、转染si-RNA组诱导分化的Tfh细胞比例分别为(12.38±1.97)％、(21.17±0.75)％,转染si-RNA组Tfh细胞分化比例较高，且差异具有统计学意义(P=0.014)。<br>　　7.T-B细胞体外共培养后B细胞亚群的比例<br>　　未转染组和转染si-RNA组SMB细胞比例为:(0.58±0.13)％,(4.12±1.01)％,转染si-RNA组高于未转染组，差异有统计学意义(P=0.017),两组na?veB细胞亚群比例分别为(35.17±2.24)％、(24.93±4.43)％,转染si-RNA组低于未转染组，但差异无统计学意义(P=0.066)。<br>　　8.T-B细胞体外共培养后分泌IgG、IgM水平<br>　　两组的IgG浓度随共培养时间延长而增加，且转染组IgG浓度较高，比较第8天时两组IgG浓度，未转染组为(5.96±0.50)ng/mL,转染si-RNA组为(9.26±0.88)ng/mL,差异有统计学意义(P=0.032);两组IgM浓度在2、4、6、8天未见明显差异，比较第8天时两组IgM浓度，未转染组为(10.441±0.13)ng/mL,转染si-RNA组为(10.28±0.63)ng/mL,差异无统计学意义(P=0.855)。<br>　　结论:<br>　　1.NMO患者外周血Tfh细胞、类型转换的记忆B细胞、IL-6、IL-21水平高于健康对照组，且急性期高于缓解期，与EDSS评分呈正相关，NMO患者幼稚B细胞比例、CD4+T细胞的Roquin表达水平低于健康对照组，Roquin相对表达量与Tfh细胞比例、EDSS评分呈负相关，提示体液-细胞免疫紊乱介导NMO的发病，Roquin可能在NMO的自身免疫中起保护作用。<br>　　2.Roquin抑制的幼稚CD4+T细胞向Tfh细胞分化比例增多，诱导B细胞向类型转换的记忆B细胞分化、IgG分泌增多，提示Roquin可能通过调控Tfh细胞分化及Tfh与B细胞的相互作用参与抗体介导的免疫反应。