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摘要实验目的：<br>　　1.探讨脊髓背角中Cav3.2 T型钙离子通道在骨癌痛痛觉敏化中的作用。<br>　　2.探讨骨癌痛中IGF-1/HIF-1α信号通路对脊髓背角Cav3.2 T型钙通道的调控作用。<br>　　实验方法：<br>　　1.Cav3.2 T型钙离子通道在骨癌痛中的作用<br>　　采用随机数字表法将大鼠分为3组:实验组（BCP组）、假手术组（Sham组）、空白对照组（Naive组）。多时间点使用X线和MicroCT检测大鼠骨质破坏情况;分别测试三组术前1d、术后3、7、14和21d大鼠术侧后足机械性缩足阈值（Paw withdrawal threshold,PWT）和热缩足潜伏期（Paw withdrawal latency,PWL）,并利用Western Blot技术检测各时间点BCP组和Sham组大鼠脊髓背角中Cav3.2蛋白水平的表达变化。利用免疫荧光技术检测BCP大鼠脊髓背角中Cav3.2的表达变化及细胞表达类型。<br>　　采用随机数字表法将大鼠分为2组:7d组和14d组，分别进行手术。术后再次采用随机数字表法将各组分为3组:Sham+Ctrl siRNA组、BCP+Ctrl siRNA组和BCP+Cav3.2 siRNA组。各组大鼠行鞘内置管，不同时间点连续3d重复鞘内给予Ctrl siRNA或Cav3.2 siRNA。采用Von Frey纤维丝和热痛仪测量PWT和PWL变化情况，Western Blot技术检测siRNA的敲低效果。验证脊髓背角中Cav3.2 T型钙通道在BCP发生和维持中的作用。<br>　　2.IGF-1/IGF-1R对Cav3.2T型钙离子通道在骨癌痛中的调控作用<br>　　BCP术后，利用Western Blot技术检测各时间点大鼠脊髓背角中IGF-1和IGF-1R蛋白水平的表达变化。利用免疫荧光技术检测脊髓背角中IGF-1R和Cav3.2共表达情况。<br>　　为了验证IGF-1对Cav3.2的调控作用，体外实验中使用50ng/ml的IGF-1重组蛋白处理PC12细胞，Western Blot技术检测不同处理时间点Cav3.2蛋白表达情况。在体实验中采用随机数字表法将大鼠分为3组:Sham+NS组、BCP+NS组和BCP+JB1组,各组大鼠术后14d开始连续3d重复鞘内给予NS或JB1。采用VonFrey纤维丝和热痛仪测量PWT和PWL变化情况。采用Western Blot技术检测BCP大鼠脊髓背角中HIF-1α和Cav3.2蛋白水平的表达变化。<br>　　3.HIF-1α在IGF-1/Cav3.2信号通路中的作用<br>　　体外实验中，将HIF-1α siRNA预转染PC12细胞24h后和IGF-1(50ng/ml)共处理48h,采用Western Blot技术检测HIF-1α和Cav3.2蛋白水平的表达变化。在体实验中于BCP术后，利用Western Blot技术检测各时间点大鼠脊髓背角中HIF-1α总蛋白以及核蛋白水平的表达变化。<br>　　为了探讨HIF-1α对Cav3.2的调控作用，采用随机数字表法将大鼠分为3组:Sham+Ctrl siRNA组、BCP+Ctrl siRNA组和BCP+HIF-1α siRNA组，各组大鼠行鞘内置管连续3d重复鞘内给予Ctrl siRNA或HIF-1α siRNA。采用Von Frey纤维丝和热痛仪测量PWT和PWL变化情况。采用Western Blot技术检测BCP大鼠脊髓背角中Cav3.2蛋白水平的表达变化。BCP大鼠术后14d连续3d重复鞘内注射JB1,检测BCP大鼠脊髓背角中HIF-1α核蛋白水平的表达变化。<br>　　采用凝胶迁移实验(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA)对HIF-1α 在转录水平对Cav3.2调控作用进行探讨。<br>　　实验结果：<br>　　1.大鼠脊髓背角神经元中Cav3.2 T型钙离子通道介导骨癌痛的发生与维持<br>　　X线结果表明，与Sham组大鼠比较，BCP大鼠在MRMT-1肿瘤细胞植入后第14d检测到明确的区域性骨质破坏，在术后第21d出现溶骨性病变。Micro CT三维重建结果表明，BCP术后期大鼠胫骨部分周围的骨小梁和骨皮质有明显破坏。疼痛行为学结果表明，BCP大鼠PWT和PWL值于术后7d显著下降，并维持到造模后21d,而PWT和PWL在Sham组以及Naive组之间没有显示出明显的差异。上述结果表明，BPC模型可以诱导大鼠出现溶骨性破坏和慢性痛觉过敏。<br>　　与Sham组相比，BCP组大鼠于造模后7d脊髓背角中Cav3.2蛋白表达上调，于14d达到最高，并持续至术后21d。免疫荧光单染结果表明，与对侧相比，BCP组大鼠造模侧脊髓背角中Cav3.2阳性细胞数增加。免疫荧光双染结果表明，BCP大鼠脊髓背角中Cav3.2与神经元（神经元核抗原，NeuN）高度共表达，在小胶质细胞（小胶质细胞特异性标志物IBA1）中稀疏共表达，在星形胶质细胞（胶质纤维酸性蛋白GFAP）中无共表达。这些结果提示，可能是脊髓背角神经元中的Cav3.2通道参与了BCP痛觉敏化的过程。<br>　　Western Blot结果表明，与Ctrl siRNA处理组相比，Cav3.2 siRNA显著抑制了BCP大鼠脊髓中的Cav3.2蛋白表达。疼痛行为学结果表明，无论在骨癌痛早期还是维持期，与对照组相比，重复鞘内给予Cav3.2 siRNA在48小时内显著地减轻了BCP大鼠的PWT和PWL值，并持续了 72h。这些结果表明Cav3.2 T型钙通道在骨癌痛早期和维持期都发挥关键作用。<br>　　2.IGF-1/IGF-1R通过调控Cav3.2T型钙离子通道参与骨癌痛的发生与维持<br>　　Western Blot结果表明，与Sham组大鼠相比，BCP大鼠脊髓背角中IGF-1的表达从14至21d明显增加，IGF-1R自术后3d则出现了有统计学差异的上调并维持到了 21d。免疫荧光双染结果表明，IGF-1R与Cav3.2在Sham组大鼠和BCP大鼠中均有共表达。但与Sham组相比，BCP大鼠14d脊髓背角浅层中IGF-1R和Cav3.2的共表达明显增加。这一结果为IGF-1调控Cav3.2提供了形态学基础。<br>　　与PBS治疗组相比，在50ng/ml的IGF-1处理PC12细胞后Cav3.2蛋白表达出现时间依赖性地增加，在24和48h,Cav3.2蛋白表达上调出现统计学差异。疼痛行为学结果表明，在BCP术后14d,与对照组相比，重复鞘内给药IGF-1抑制剂JB1,1h后可显著减弱BCP诱导的机械和热痛觉过敏，并维持到注射后72 h。Western Blot结果表明，与NS治疗组相比，BCP大鼠鞘内应用JB-1可显著抑制脊髓背角中Cav3.2蛋白的表达。这些结果表明，IGF-1/IGF-1R信号通路在BCP发生过程中参与了 Cav3.2T型钙通道的上调。<br>　　3.IGF-1通过调控HIF-1α与Cav3.2T型钙通道启动子区结合正向调控Cav3.2表达<br>　　PC12细胞经IGF-1处理后，HIF-1α蛋白的表达明显增加，而在HIF-1α siRNA存在的情况下，IGF-1诱导的HIF-1α和Cav3.2蛋白的上调几乎完全被逆转了。这些结果提示，在PC12细胞中HIF-1α参与了IGF-1对Cav3.2通道的调控。<br>　　Western Blot结果表明，与Sham组大鼠相比,BCP大鼠同侧脊髓背角中HIF-1α总蛋白表达在21d时出现了明显增加，而HIF-1α核蛋白自第7d开始则出现明显增加，并维持到了第21d。疼痛行为学结果表明，在骨癌痛早期，与对照组相比，重复鞘内给药的HIF-1α siRNA在48h内极大地减弱了BCP大鼠的PWT和PWL值,并持续了 72h。这些结果提示，HIF-1α的上调在BCP的发展中起着重要作用。<br>　　NS治疗组相比，BCP大鼠鞘内应用JB-1可显著抑制脊髓中HIF-1α蛋白的表达。Western Blot结果表明，与对照组大鼠相比，HIF-1α siRNA的应用可以显著降低BCP大鼠脊髓背角中Cav3.2通道的上调。凝胶迁移实验结果表明，与Sham组相比，BCP术后HIF-1α核蛋白与Cav3.2标记探针的结合明显增加，而这些蛋白-探针复合物可以被未标记的冷探针竞争性抑制，同时Cav3.2突变探针无法与HIF-1α核蛋白结合，提示HIF-1α可以与Cav3.2启动子结合，并对Cav3.2的转录水平进行正向调节。这些结果表明，IGF-1作为一种激活剂，通过调节HIF-1α与Cav3.2启动子结合的积累介导骨癌痛。这些证据为骨癌诱发疼痛的调节机制提供了新的信息。<br>　　实验结论：<br>　　研究结果表明，脊髓背角神经元中Cav3.2T型电压门控钙离子通道参与大鼠骨癌痛的发生与维持，IGF-1/HIF-1α信号通路通过上调Cav3.2 T型钙通道介导骨癌痛。