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摘要目的：<br>　　结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)约占全球每年诊断出的所有癌症和癌症相关死亡的10％。是女性第二常见癌症，男性第三常见癌症，发病率随着年龄的增长而增加，预计到2035年，全球结直肠癌的发病率将增加到250万新病例。大部分结直肠癌患者的肿瘤是局部的，可通过手术治疗，有高达20％的患者会出现转移性疾病，可通过手术挽救，但化疗仍然是主要的治疗方法，手术、放射治疗和化疗是结直肠癌治疗的关键组成部分。由于化疗极易产生耐药性，且会对患者身体造成损伤，分子靶向治疗则显得尤为重要，为了抑制结直肠肿瘤的发生发展，降低患者的毒副作用，提高患者生存率，开发靶向结直肠肿瘤中特定蛋白的抑制剂已迫在眉睫。<br>　　α-倒捻子素(α-Mangostin,α-Mg)是从山竹果皮中分离出来的最具代表性的氧杂蒽酮，具有广泛的生物活性和药理特性，已被报道具有抗肿瘤、抗氧化、抗增殖、诱导凋亡等作用。本实验室利用α-Mg原有的化学结构，经过一系列变构修饰合成了一种新的化合物Mg-1,经过验证发现，与α-Mg相比，Mg-1抑制结直肠癌细胞增殖效果更显著，诱导结直肠癌细胞凋亡更明显，而且Mg-1使周期阻滞在G2/M期。体内实验也表明利用相同浓度的Mg-1和α-Mg处理人源异种移植瘤(Patient-derived xenograft,PDX)小鼠，Mg-1抑制PDX肿瘤效果更明显。<br>　　Cdc2样激酶(CDC2-like kinase,CLKs)是一种双特异性激酶，由CLK1,CLK2,CLK3和CLK4四种异构体组成，属于CMGC(周期蛋白依赖激酶(CDKs),丝裂原活化蛋白激酶(MAP激酶)，糖原合酶激酶(GSK)和CDK样激酶)。CLKs激酶可通过自身磷酸化来磷酸化底物，参与信号通路的传导、mRNA的剪接、DNA的损伤修复、细胞周期的调控等过程，可一旦CLKs激酶失调将导致多种癌症的发生，如恶性胶质瘤、肺小细胞癌、三阴性乳腺癌、胰腺癌等。CLKs激酶可通过调节富含丝氨酸/精氨酸蛋白(Serine/Arginine-rich protein,SR)家族剪接因子来促进选择性剪接(Alternative splicing,AS),SR也可与剪接增强子结合促进AS,而AS的失调与肿瘤的发生发展密切相关。<br>　　本课题利用激酶谱实验找到Mg-1可能的潜在靶点为CLK1,通过药物靶标亲和稳定性(Drug affinity responsive target stability,DARTS)实验得到验证，计算机模拟Mg-1和CLK1激酶的结合显示出Mg-1和CLK1的结合域与结合位点，敲低结直肠癌细胞中的CLK1并用Mg-1处理发现克隆没有明显改变，进一步证实Mg-1与CLK1的结合，且敲低CLK1在体内与体外都抑制结直肠癌的增殖，而过表达CLK1则促进结直肠癌细胞的增殖，此外，在结直肠癌中，CLK1可作为促癌基因与SRSF5(富丝氨酸/精氨酸剪接因子5)相互作用并磷酸化SRSF5,CLK1-SRSF5轴通过促进选择性剪接的进程从而促进结直肠癌的增殖。而Mg-1通过抑制CLK1的活性，抑制CLK1-SRSF5轴和选择性剪接的进程，从而在体内外抑制结直肠癌的增殖。<br>　　以上研究阐明了 Mg-1从体内外抑制结直肠癌的增殖以及CLK1促进结直肠癌增殖的机制，为Mg-1作为CLK1抑制剂的研发提供理论依据。<br>　　方法：<br>　　1.比较化合物Mg-1与原化合物α-Mg对结直肠癌细胞的抑制效果<br>　　通过细胞毒性实验和48 h的细胞增殖实验比较α-Mg与其衍生物Mg-1对结直肠癌细胞的抑制作用。<br>　　2.探索Mg-1在体外与体内对结直肠癌的抑制作用<br>　　在体外，通过细胞增殖实验检测Mg-1对正常结肠细胞的毒性作用及对结直肠癌细胞生长的抑制作用;采用软琼脂克隆形成实验及平板克隆实验验证Mg-1对结直肠癌细胞克隆生长的抑制作用;采用细胞周期与凋亡实验以及蛋白免疫印迹实验验证了 Mg-1阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡。在体内，通过PDX动物模型以及每日Mg-1处理实验组小鼠，观察Mg-1抑制结直肠癌的能力。<br>　　3.证明CLK1可作为Mg-1的靶点治疗结直肠癌<br>　　利用激酶谱实验找到了 Mg-1的潜在靶点可能是CLK1;通过药物亲和反应的靶点稳定性实验验证CLK1是Mg-1的靶点;并用分子对接模型模拟Mg-1与CLK1的结合域以及结合位点;敲低结直肠癌细胞中的CLK1并用Mg-1处理细胞观察克隆的变化证实Mg-1与CLK1的结合;采用蛋白免疫印迹实验检测在结直肠癌中Mg-1对CLK1的抑制作用。<br>　　4.探索CLK1在结肠癌中的功能<br>　　通过TCGA数据库查看CLK1在结直肠癌中的表达水平以及与结直肠癌患者生存率的关系;对结直肠癌芯片进行免疫组化染色，分析CLK1与p-CLK1的表达水平;采用蛋白免疫印迹实验观察CLK1在结直肠癌细胞与正常结肠细胞中的表达水平;通过敲低结直肠癌细胞中的CLK1，并利用CDX动物模型观察CLK1在体内对结直肠癌的影响;过表达结直肠癌细胞中的CLK1观察其对结直肠癌细胞增殖的影响。<br>　　5.探索Mg-1通过靶向CLK1抑制结直肠癌增殖的机制<br>　　通过外源性免疫共沉淀与内源性免疫共沉淀找到与CLK1互相结合的蛋白SRSF5;利用γ-32P放射性同位素标记法与体外激酶实验发现CLK1磷酸化SRSF5;敲低CLK1与SRSF5,采用核斑点实验观察CLK1-SRSF5轴对选择性剪接的调节以及利用MTT实验观察敲低SRSF5后对结直肠癌细胞增殖的影响;过表达SRSF5,采用核斑点实验观察其对结直肠癌细胞选择性剪接的调节以及利用MTT实验观察其对结直肠癌细胞增殖的影响;Mg-1处理结直肠癌细胞，采用核斑点实验观察Mg-1对CLK1-SRSF5轴调控的选择性剪接的影响。<br>　　结果：<br>　　1. Mg-1对结直肠癌细胞的抑制作用优于原化合物α-Mg。<br>　　2.与对照组相比，Mg-1在体内与体外以浓度梯度和时间梯度方式抑制结直肠癌的增殖，阻滞HCT116细胞和SW480细胞周期于G2/M期并诱导细胞凋亡。<br>　　3.激酶谱实验、药物亲和反应的靶点稳定性实验、分子对接模型、敲低CLK1并用Mg-1处理后结直肠癌细胞克隆的变化揭示了 CLK1是Mg-1的靶点,且蛋白免疫印迹实验证明了 Mg-1抑制结直肠癌CLK1的活性。<br>　　4. TCGA数据分析、免疫组化处理结直肠癌组织芯片和蛋白免疫印迹实验表明CLK1在结直肠癌中高表达，敲低CLK1在体内外抑制结直肠癌的增殖，而过表达CLK1则促进结直肠癌细胞的增殖。<br>　　5.免疫共沉淀与激酶实验表明CLK1与SRSF5相互作用并磷酸化SRSF5,核斑点实验证明了敲低CLK1和SRSF5可抑制选择性剪接的进程，从而抑制结直肠癌细胞的增殖，而过表达SRSF5可促进选择性剪接的进程，从而促进结直肠癌细胞的增殖，化合物Mg-1可通过靶向CLK1-SRSF5轴抑制选择性剪接的进程，抑制结直肠癌的增殖。<br>　　结论：<br>　　Mg-1通过靶向CLK1，抑制CLK1-SRSF5轴介导的选择性剪接，从而抑制结直肠癌的增殖。