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摘要背景和目的<br>　　肺癌是世界上最常见和最严重的癌症之一，全世界每年大约有25万人确诊,是人类因癌症死亡的主要原因。其中非小细胞肺癌患者的数量(NSCLC)占所有肺癌患者总量的80％-85％。大约有四分之一的患者在被诊断出NSCLC时可通过手术切除根治，临床Ⅰ期NSCLC病人在完全切除后的5年存活率在50％到70％之间，而ⅢA期NSCLC病人的5年存活率仅在10％到30％之间。手术后辅助化疗等方式稍微改善了5年生存率，但超过一半的患者仍然会复发。近年来，肿瘤分子靶向治疗能特异性地抑制肿瘤细胞的增殖与转移能力，诱导细胞凋亡，并且由于治疗靶点的特异性，靶向治疗比传统治疗对患者的毒副作用更小。<br>　　表皮生长因子受体(Epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)被认为是NSCLC治疗中最重要的治疗靶点之一。EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)的出现为肺癌的治疗带来了新的方向。吉非替尼(Gefitinib)是一种选择性EGFR-TKI,被用于EGFR基因突变的NSCLC患者的临床一线治疗，具有良好的治疗效果，但是大多数患者仍会在治疗后的10-12个月内不可避免地出现获得性耐药，目前具体机制尚不清楚。因此，深入研究NSCLC细胞吉非替尼获得性耐药的分子机制，探索逆转吉非替尼耐药的方法对目前肺癌的临床治疗极其重要。<br>　　本研究前期通过对带有EGFR基因突变并且吉非替尼敏感的肺癌细胞株PC-9进行为期六个月的一定剂量的吉非替尼诱导处理，成功构建吉非替尼耐药株(命名为PC-9/G)。通过对比PC-9与PC-9/G细胞的功能，发现耐药细胞具有更强的糖酵解能力，且糖酵解关键基因PDK1(Pyruvatedehydrogenasekinase1,丙酮酸脱氢酶激酶1)显著高表达。PDK1基因属于线粒体蛋白激酶家族，在多类肿瘤中高表达，与较差的预后生存密切相关。但PDK1基因在肺癌吉非替尼耐药中的作用机制尚无研究，我们在此研究中阐释了下面3个科学问题:(1)PDK1基因在肺癌吉非替尼获得性耐药中扮演什么角色;(2)在肺癌细胞对吉非替尼产生获得性耐药的过程中，PDK1基因受到哪些信号分子的调控;(3)探索小分子抑制剂能否改善因PDK1基因表达上调而引起的肺癌吉非替尼获得性耐药。<br>　　本研究旨在阐明PDK1基因在调控吉非替尼耐药过程里发挥的作用和具体分子机制，为改善EGFR-TKIs耐药奠定理论基础，提供新的研究方向。<br>　　方法<br>　　(1)明确PDK1基因在肺癌吉非替尼耐药过程中的表达水平及临床意义。<br>　　首先分析吉非替尼敏感细胞(PC-9)与吉非替尼耐药细胞(PC-9/G)的功能差异，发现两种细胞的糖酵解水平存在显著差异，PDK1基因在吉非替尼耐药细胞中显著高表达。利用TCGA数据分析PDK1基因的表达与肺癌患者生存预后的关系，通过WesternBlotting实验与qRT-PCR实验检测了PDK1基因在吉非替尼耐药细胞中的表达。利用慢病毒包装载体在PC-9细胞与PC-9/G细胞中分别构建了过表达与沉默PDK1基因的稳定株，并用稳定株细胞进行吉非替尼敏感性实验、细胞增殖、迁移、凋亡、葡萄糖消耗及乳酸生成等细胞功能实验，来明确PDK1基因在肺癌吉非替尼耐药中发挥的作用。<br>　　(2)探索表观遗传修饰在调控PDK1基因表达中发挥的作用和分子机制。<br>　　首先在基因的转录调控层面，利用Starbase网站与TCGA数据库在肺腺癌与肺鳞癌中进行相关性研究，找出与PDK1基因具有高度相关性的组蛋白去甲基化酶成员，用WesternBlotting实验、qRT-PCR实验与染色质免疫沉淀实验探索组蛋白去甲基化酶3A(KDM3A)与PDK1基因的关系。在RNA的转录后修饰层面，首先通过Dotblot实验分析吉非替尼耐药细胞与敏感细胞中的N6-腺苷酸甲基化(m6A)水平，接着研究m6A甲基转移酶METTL16和RNA结合蛋白IGF2BP1对PDK1mRNA的调控作用。利用SRAMP网站和RMBase网站预测PDK1mRNA上的潜在的m6A结合位点，最后用双荧光素酶报告基因实验以及RIP实验进一步明确PDK1mRNA受到m6A修饰的调控。利用慢病毒包装载体在PC-9细胞与PC-9/G细胞中构建了KDM3A基因、METTL16基因和IGF2BP1基因的过表达及沉默稳定细胞系，并验证稳定株细胞的药物敏感性、细胞增殖能力、迁移等功能，最终明确表观遗传修饰调控PDK1基因表达的分子机制。<br>　　(3)研究PDK1抑制剂是否显著改善吉非替尼耐药细胞的治疗效果。<br>　　首先用递增浓度的PDK1抑制剂JX06处理吉非替尼耐药细胞PC-9/G及敏感细胞PC-9,验证JX06对PDK1蛋白的抑制效果。接着用梯度浓度的吉非替尼与JX06共同处理PC-9/G细胞，并进行药物敏感性检测，验证JX06与吉非替尼是否具有协同作用。然后挑选合适的药物浓度组合进行细胞凋亡检测、TUNEL实验以及线粒体膜电位实验，观察两药联合对耐药肺癌细胞的治疗效果。最后用PC-9/G细胞构建异种移植瘤模型在体内水平进一步明确JX06联合吉非替尼改善耐药性的效果和分子机制。<br>　　结果<br>　　(1)相比吉非替尼敏感细胞PC-9,吉非替尼耐药的PC-9/G细胞具有更高的糖酵解水平，且糖酵解关键基因PDK1在耐药肺癌细胞和肺癌患者的临床组织样本中都显著高表达。沉默PDK1基因可提高PC-9/G细胞对吉非替尼的敏感性，促进细胞凋亡，降低葡萄糖消耗与乳酸生成，并抑制细胞的增殖和迁移能力。<br>　　(2)数据库分析发现PDK1基因的表达水平与组蛋白去甲基化酶KDM家族有较强的相关性，其中KDM3A与PDK1的相关性最高，KDM3A与PDK1基因的表达水平呈显著正相关。KDM3A表达水平在PC-9/G细胞中显著升高，且高表达KDM3A基因的患者具有更差的预后效果，生存期缩短。<br>　　(3)沉默KDM3A基因后，PC-9/G细胞对吉非替尼的敏感性提高，细胞增殖、迁移能力下降，细胞凋亡率上升。WesternBlotting检测发现，在沉默KDM3A基因后，其去甲基化酶作用位点蛋白H3K9me1和H3K9me2的表达水平上升，而PDK1基因的表达水平下调。染色质免疫沉淀实验证明KDM3A可直接与PDK1基因的启动子区域结合，KDM3A通过去甲基化修饰促进PDK1的表达。<br>　　(4)PC-9/G细胞具有更高的m6A水平，并且m6A相关的“Writer”蛋白METTL16和“Reader”蛋白IGF2BP1的表达水平都明显高于PC-9细胞。在PC-9/G细胞中沉默METTL16基因，可降低细胞内的m6A水平，增加其对吉非替尼的敏感性，并降低细胞的增殖与迁移能力，促进细胞凋亡。<br>　　(5)双荧光素酶报告基因和RIP实验证明PDK1mRNA上存在METTL16结合位点。在PC-9/G细胞中沉默METTL16基因，可显著缩短PDK1mRNA的半衰期，相反在PC-9细胞中过表达METTL16基因可显著提高其半衰期，这表明METTL16可增加PDK1mRNA的稳定性,METTL16参与了PDK1mRNA的m6A修饰。此外，在PC-9/G细胞中沉默IGF2BP1基因也可显著降低PDK1mRNA的半衰期，说明IGF2BP1可能通过发挥m6A“Reader”的功能参与PDK1mRNA的m6A修饰。<br>　　(6)JX06与吉非替尼具有药物协同作用，且吉非替尼与JX06联合使用可显著提高PC-9/G细胞的凋亡率。动物实验证明JX06联合吉非替尼处理组的裸鼠肿瘤生长速度、肿瘤重量均小于JX06/吉非替尼单药处理组与正常组。以上实验结果证明JX06可提高耐药肺癌细胞对吉非替尼的敏感性。<br>　　结论<br>　　(1)糖酵解关键基因PDK1的异常高表达促进肺癌细胞对吉非替尼治疗产生抗性，干扰PDK1基因的表达可显著改善细胞对吉非替尼的敏感性。<br>　　(2)KDM3A通过去甲基化H3K9me1和H3K9me2激活PDK1基因的转录，进而促进肺癌细胞的增殖、迁移和对吉非替尼药物的耐受性。<br>　　(3)PC-9/G细胞具有更高的m6A修饰水平，METTL16/IGF2BP1参与PDK1mRNA的m6A修饰，增加PDK1mRNA的稳定性，显著促进PDK1基因的表达。<br>　　(4)联合PDK1抑制剂JX06可显著提高吉非替尼对肺癌耐药细胞的治疗效果，为解决临床上EGFR-TKIs治疗耐药问题提供了新的思路。