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摘要研究背景及目的<br>　　根据世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）2020年最新发布的全球癌症数据，共统计了185个国家36种癌症的发病率和死亡率。其中全球发病率最高的癌症——乳腺癌，2020年全年全球新发乳腺癌患者约为226万（占比11.7％）,乳腺癌死亡病例68万（占比6.9％）。2020年全球女性新发癌症920万例，占全球新发癌症总数的48％。全球女性新发病例数前十的癌症分别为:乳腺癌225万，结直肠癌87万，肺癌77万，宫颈癌60万，甲状腺癌45万，子宫内膜癌41万，胃癌37万，卵巢癌31万，肝癌28万，非霍奇金淋巴瘤24万，这十种癌症约占女性新发癌症数量的71％。目前，我国乳腺癌的预后生存率为82％,这一数据仍与发达国家存在一定差距（90.9％）。如今乳腺癌的治疗手段主要还是以外科手术切除的方法为主，并同多种辅助疗法一起使用，如化学疗法、放射疗法、激素疗法还有靶向疗法等。尽管多数患者通过这些治疗手段使病情得以改善，但是仍然有一部分患者表现为较差的预后。因此，深入探索乳腺癌细胞恶性增殖、转移的发病机制，寻找更多潜在的分子靶点，不论是对医务人员或患者还是对科研工作者都具有巨大的临床意义。异常的细胞增殖的细胞分裂失调是癌症的主要标志之一，因此阻断细胞分裂的治疗靶点对癌症的治疗是有效的。细胞分裂主要是由细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK,Cyclindependentkinase）组成的复合物控制。目前以CDK4/6为靶点治疗乳腺癌的药物已获批进入临床使用，关于CDK9的研究，已有研究发表文献证明CDK9的高表达与骨肉瘤、卵巢癌、滑膜肉瘤等癌种的进展，复发和转移显着相关，因此可以作为一种新的预后和预测生物标志物。但是在乳腺癌中CDK9的表达情况还未知，因此本课题以乳腺癌中CDK9的表达及作用机制作为研究切入点，进行了该研究。通过明确CDK9在乳腺癌中对细胞功能的影响及分子机制，拟为乳腺癌的靶向治疗提供新的靶点理论依据，促进乳腺癌治疗的发展以及改善对患者的治疗和预后。<br>　　方法<br>　　1.应用CellCountingKit-8(CCK-8)实验和克隆形成实验检测特异性CDK9siRNA处理MDA-MB-231细胞、MDA-MB-468细胞、MCF-7细胞及不同浓度高选择性CDK9抑制剂LDC000067处理MDA-MB-231细胞、MDA-MB-468细胞、MCF-7细胞对细胞增殖活性的影响。<br>　　2.通过荧光显微镜观察不同浓度高选择性CDK9抑制剂LDC000067处理MDA-MB-231细胞、MDA-MB-468细胞、MCF-7细胞对细胞形态及凋亡的影响。<br>　　3.利用划痕实验和Transwell细胞体外迁移实验观察不同浓度高选择性CDK9抑制剂LDC000067处理MDA-MB-231细胞、MDA-MB-468细胞、MCF-7细胞对细胞迁移能力的影响。<br>　　4.应用实时定量荧光PCR技术检测特异性CDK9siRNA处理MDA-MB-231细胞、MDA-MB-468细胞、MCF-7细胞后，细胞中CDK9基因表达情况。<br>　　5.构建体外动物模型，探索高选择性CDK9抑制剂LDC000067对乳腺癌小鼠肿瘤发展的影响。<br>　　6.应用Westernblot检测HBL-100/人乳腺细胞HBL-100、MDA-MB-231细胞、MDA-MB-468细胞及MCF-7细胞中CDK9蛋白表达情况，特异性CDK9siRNA处理MDA-MB-231细、MDA-MB-468细胞、MCF-7细胞及不同浓度高选择性CDK9抑制剂LDC000067处理MDA-MB-231细胞、MDA-MB-468细胞、MCF-7细胞后，细胞中CDK9蛋白及相关凋亡蛋白表达情况。<br>　　7.使用GraphPadPrism8软件来进行统计学分析，计量资料采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t法，数据以(x)±s表示，以P＜0.05为差异具有统计学意义。<br>　　结果<br>　　1.Westernblot结果显示，MDA-MB-231细胞、MDA-MB-468细胞及MCF-7细胞中CDK9蛋白表达水平显著高于HBL-100/人乳腺细胞HBL-100<br>　　2.生长曲线和细胞克隆形成实验结果显示，特异性CDK9siRNA及不同浓度高选择性CDK9抑制剂LDC000067处理MDA-MB-231细胞、MDA-MB-468细胞、MCF-7细胞后，细胞增殖活性出现剂量依赖性降低（P＜0.01）。<br>　　3.荧光显微镜观察显示，不同浓度高选择性CDK9抑制剂LDC000067处理MDA-MB-231细胞、MDA-MB-468细胞、MCF-7细胞后，随着浓度增高细胞形态发生改变且细胞发生明显凋亡。<br>　　4.划痕实验和Transwell细胞体外迁移实验结果显示，不同浓度高选择性CDK9抑制剂LDC000067处理MDA-MB-231细胞、MDA-MB-468细胞、MCF-7细胞后细胞迁移能力出现剂量依赖性降低（P＜0.01）。<br>　　5.动物实验结果表明，10mg/kg高选择性CDK9抑制剂LDC000067抑制乳腺癌小鼠肿瘤生长。<br>　　6.实时定量荧光PCR技术检测显示特异性CDK9siRNA处理MDA-MB-231细胞、MDA-MB-468细胞、MCF-7细胞后CDK9基因表达降低（P＜0.01）。<br>　　7.特异性CDK9siRNA处理MDA-MB-231细胞、MDA-MB-468细胞、MCF-7细胞后CDK9蛋白表达明显降低，凋亡相关蛋白表达也发生改变，不同浓度高选择性CDK9抑制剂LDC000067处理MDA-MB-231细胞、MDA-MB-468细胞、MCF-7细胞后CDK9蛋白表达水平不变，凋亡相关蛋白表达发生改变。<br>　　结论<br>　　1.CDK9在乳腺癌细胞中高表达。<br>　　2.抑制CDK9表达，可降低乳腺癌细胞增殖、迁移能力，促进细胞凋亡。<br>　　3.抑制CDK9导致乳腺癌细胞增殖、迁移能力减少的机制可能是通过抑制相关凋亡蛋白表达来完成。