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摘要背景<br>　　在全球范围内，食管癌(esophagealcancer,EC)的发病率在恶性肿瘤中排第七,总死亡率排第六,其最常见的亚型是鳞状细胞癌。食管鳞状细胞癌(esophagealsquamouscellcarcinoma,ESCC)又是河南省特征性高发重大疾病，是发病率高、预后较差的实体瘤之一，严重制约着全省人民平均健康素质的提高。近几十年来，尽管手术治疗、放射治疗、新辅助放化疗、靶向治疗及免疫治疗的联合治疗策略让食管癌患者见到了曙光，但多数病人会出现局部复发和远处转移，5年生存率较低。目前尚缺乏行之有效且安全的诊疗方案，因此，亟需探究食管癌新的治疗策略及复发转移和药物耐药的分子机制。<br>　　肿瘤的复发和转移与其血管生成联系密切。在临床上，应用抗血管生成药物的肿瘤患者仍会出现复发和转移，提示可能存在一种不同于传统血管的微循环模型。血管生成拟态(vasculogenicmimicry,VM)作为一种新提出的肿瘤血管生成模式，与经典血管生成模式不同，它是由肿瘤细胞发生上皮到内皮表型转换，进而构成的类血管样结构，可以为肿瘤传输一定的血液和营养物质。在多种恶性肿瘤中都有发现VM的存在，且与肿瘤的复发、转移、药物耐药及患者的不良预后密切相关。<br>　　Notch蛋白是发育过程中的单通道跨膜受体，在肿瘤的发生、发展和血管生成中起着至关重要的作用。有研究表明，Notch1参与肿瘤VM的形成，且与肿瘤的复发和转移密切相关。在肝细胞癌和胶质母细胞瘤中，Notch1可以调节肿瘤VM的形成。但是，有关Notch1是否参与食管癌VM形成及其分子机制的报道较少。<br>　　全反式维甲酸(all-transretinoicacid,ATRA)是维生素A的活性代谢物，在急性早幼粒细胞白血病的治疗中起着关键作用。我们前期研究发现ATRA通过抑制血管生成素-Tie2通路抑制食管癌EC1细胞裸鼠移植瘤的血管生成。但ATRA是否能调控Notch1抑制食管癌VM的形成，目前尚未见相关的文献报道。因此，本研究开展相应的实验探究:(1)Notch1对食管鳞状细胞癌VM形成和细胞增殖的影响;(2)ATRA能否通过调控Notch1抑制食管鳞状细胞癌VM形成和细胞增殖。本课题的研究将以“老药新用”的角度揭示ATRA新的抗肿瘤机制，并为其在食管癌抗血管生成治疗的药物耐药问题提供新的治疗策略和理论依据。<br>　　目的<br>　　探讨ATRA对食管鳞状细胞癌体外形成VM的影响;探讨Notch1对食管鳞状细胞癌体外形成VM的影响;探讨ATRA抑制食管鳞状细胞癌VM形成的分子机制。<br>　　方法<br>　　通过对食管鳞状细胞癌EC1、EC109、KYSE150和KYSE450细胞系进行体外三维培养，比较其血管样结构的形成能力，并进行定量分析，以筛选血管样结构形成能力最强的细胞系作为后续实验的靶细胞。CCK-8实验被用来检测ATRA对细胞增殖的影响;通过药物干预实验，检测不同浓度的ATRA对靶细胞形成血管样结构的影响;采用RT-qPCR和WesternBlot检测ATRA对食管癌细胞系Notch1基因mRNA和蛋白水平的影响;构建Notch1受体胞内结构域(Notch1receptorintracellulardomain,NICD)质粒，慢病毒转染EC109细胞，并用嘌呤霉素筛选出NICD稳定高表达的细胞系EC109-NICD,利用RT-qPCR和WesternBlot检测NICD在mRNA水平及蛋白水平的表达;通过三维培养实验观察比较Notch1高表达细胞系EC109-NICDVM的形成能力，用CCK-8法检测Notch1基因对细胞增殖的影响。<br>　　结果<br>　　（1）在4个食管癌鳞状细胞癌EC1、EC109、KYSE150和KYSE450细胞系中，三维培养实验证明，食管鳞状细胞癌可以在体外形成VM,定量分析显示EC109细胞系形成VM的能力最强。<br>　　（2）药物干预实验中，ATRA在体外随着作用时间的增加，抑制EC109细胞系的增殖能力越强，以浓度依赖的形式抑制其VM形成。<br>　　（3）食管鳞状细胞癌细胞系进行RT-qPCR实验，结果显示EC109细胞Notch1基因的表达水平明显低于EC1、KYSE150和KYSE450组细胞基因表达水平，且差异具有统计学意义。RT-qPCR和WesternBlot检测结果均显示，在EC109细胞中加入ATRA后，Notch1基因mRNA水平和蛋白水平表达被明显上调，差异具有统计学意义。<br>　　（4）RT-qPCR和WesternBlot检测基因表达水平，结果显示与空载质粒组相比，EC109-NICD细胞株中Notch1表达显著上调，差异有统计学意义，这证实成功构建了Notch1高表达的EC109细胞株。<br>　　（5）三维培养实验结果显示，上调Notch1表达可以在体外抑制食管鳞状细胞癌VM的形成;CCK-8细胞增殖实验证明高表达Notch1基因可以抑制食管癌细胞的增殖。<br>　　结论<br>　　（1）食管鳞状细胞癌可以在体外形成VM;<br>　　（2）ATRA可在体外抑制食管鳞状细胞癌VM的形成及其细胞增殖;<br>　　（3）ATRA可在体外上调EC109细胞Notch1基因的表达，进而抑制食管鳞状细胞癌VM的形成及其细胞增殖。