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摘要背景:骨缺损因骨组织破坏易出现愈合不良，移植骨形态发生蛋白2(Bonemorphogeneticproteins2,BMP2)基因转染的骨髓间充质干细胞(Bonemesenchymalstemcells,BMSCs)为骨缺损治疗带来了希望。超声靶向破坏微泡技术(Ultrasound-targetedmicrobubbledestruction,UTMD)是近年提出的一种较安全的基因转染新方法。然而，由于荷载基因的空化核位于细胞外，难以高效突破细胞核膜屏障，因此转染效率偏低。<br>　　目的:构建亲核型纳米基因递送系统BMP2-CNGVs@BMSCs(BMP2-Cationicnucleophilicgasvesicles@BMSCs),协同UTMD技术激发细胞内空化效应，有效提高BMSCs核膜通透性，介导BMP2基因高效入核转染，为促进骨缺损修复提供一种有前途的靶向基因递送策略。<br>　　方法:1、构建亲核型纳米基因递送系统BMP2-CNGVs@BMSCs:首先使用生物泡(gasvesicles,GVs)、聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)、核定位信号肽(Nuclearlocalizationsignal,NLS)通过静电吸附法制备阳离子化亲核型纳米基因载体CNGVs,琼脂糖凝胶电泳实验检测CNGVs负载BMP2质粒的能力，形成转染复合物BMP2-CNGVs,并对转染复合物BMP2-CNGVs与BMSCs的孵育时间和超声参数进行优化，以提高转染效率。<br>　　2、NLS靶向核膜及核膜开放效果的研究:共聚焦荧光显微镜对NLS靶向核膜效果进行检测;使用透射电子显微镜、实时共聚焦成像、三维共聚焦成像技术对核膜开放效果、质粒入核效应和质粒有效核定位方面进行检测。<br>　　3、细胞内空化联合NLS介导BMP2质粒转染BMSCs的体外实验:①倒置荧光显微镜及流式细胞仪对基因转染效率进行定性和定量。②qRT-PCR和Elisa实验检测BMP2基因mRNA的转录和目的蛋白的表达。③碱性磷酸及茜素红染色法测定工程化BMSCs的成骨效能和基质矿化能力。<br>　　4、细胞内空化联合NLS介导BMP2质粒转染BMSCs的体内实验:构建3.2mm大鼠股骨缺损模型，原位注射BMP2-CNGVs@BMSCs,通过Micro-CT、组织学检测骨再生，通过免疫组织化学评估BMP2、CD34血管因子及碱性磷酸酶蛋白的分泌情况，通过HE染色进行生物安全性评估。<br>　　结果:1、成功构建阳离子化亲核型纳米基因载体CNGVs,表面Zeta电位为(26.1±2.2)mV,平均粒径(330±1.4)nm,并具有较高的质粒携带能力，含有20μgPEI的CNGVs可携带10μgBMP2质粒，形成BMP2-CNGVs。进一步筛选出BMSCs最大化吞噬BMP2-CNGVs的孵育时间为9h,构建BMP2-CNGVs@BMSCs,且筛选出最佳超声辐照参数为中心频率1.5MHZ、占空比20％、声压120mvpp、辐照时间2.5min。<br>　　2、共聚焦显微镜下观察到BMP2-CNGVs组较BMP2-CGVs组的质粒能更快在BMSCs核膜胞质侧富集，甚至少量质粒进入细胞核，证实NLS具有靶向核膜的特性。超声介导细胞内空化后，透射电子显微镜下观察到290nm的可逆性核膜开放孔隙，共聚焦显微镜实时成像观察到质粒动态入核，三维共聚焦成像观察在YZ和YZ平面，质粒与细胞核共定位。<br>　　3、细胞内空化+NLS组质粒的核导入率达82.7％,比传统细胞外空化组高3.9倍，实现61％的转染效率，且至少持续表达14d,BMP2基因mRNA的表达是只转染BMP2质粒组的37.3倍，并且上清液中BMP2蛋白的表达量维持在较高水平，达到激发成骨效应的阈剂量，而且工程化BMSCs具有较强的成骨分化效能和基质矿化能力。<br>　　4、Micro-CT与组织学分析表明，与传统细胞外空化组和细胞内空化组相比，细胞内空化+NLS组能显著改善股骨缺损的血管生成和骨再生，为促进骨缺损修复提供了一种安全有效的靶向基因递送策略。<br>　　结论:基于BMSCs可吞噬纳米泡的特性，成功构建了亲核型靶向纳米基因递送体系(BMP2-CNGVs@BMSCs),富集在核膜周围，再协同UTMD技术激发细胞内空化效应，有效提高细胞核膜通透性，既有利于更多外源性质粒入核，又可提供能量促进NLS介导的质粒入核转运，实现安全高效基因转染及BMP2稳定、持续表达，从而改善骨缺损的成骨环境，促进骨缺损修复。有望将基因治疗、微生物学、材料学技术相结合，为临床提供一种全方位、多层次、宽领域的新型治疗策略。