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摘要研究背景<br>　　甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤且发病率在近几十年显著增长。甲状腺乳头状癌(papillary thyroid cancer,PTC)是最常见的分化型甲状腺癌，大部分的PTC预后良好，但仍有部分高侵袭性PTC在治疗后复发，且预后不良。上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)可以使癌细胞获得更强的侵袭能力，也可以使癌细胞转化为肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)。在PTC中，EMT增强了癌细胞的侵袭能力以及肿瘤干细胞特征，并使细胞获得放射性碘抗性。此外，EMT还可以促进PTC进展为低分化甲状腺癌，预后不良。因此，了解PTC细胞EMT的特征以及探索促进PTC细胞EMT的分子机制具有重要意义。<br>　　研究方法<br>　　首先，我们应用单细胞转录组测序(single-cell RNA sequencing,scRNA-seq)方法对同一患者的PTC组织和癌旁进行分析，通过拟时序分析发现BNC1可能是上皮细胞恶变过程中具有重要作用的转录因子，且BNC1肿瘤细胞亚群表达更高的EMT特征。此后，我们利用生物信息学分析BNC1的表达水平与甲状腺癌肿瘤分期、转移、甲状腺外浸润和组织学类型等临床病理特征的关系，并分析了高表达和低表达BNC1的甲状腺癌中的微环境差异。在进行CAF的相关分析中，我们通过特征基因对细胞亚群进行了命名，并通过基因表达热图以及基因富集分析展示各亚群CAF的功能和特征，通过对比基因谱和拟时序分析部分CAF来源，并通过免疫组织化学染色实验检测GJB2 EMT-CAF与PTC组织中血管形成的相关性。最后，我们利用siRNA在PTC细胞系(TPC-1)中敲减BNC1的表达，使用EdU掺入法、划痕愈合实验和transwell细胞侵袭实验来检测抑制BNC1对TPC-1细胞的增殖、迁移和侵袭功能的影响，通过观察细胞形态和EMT特征基因的表达检测EMT状态，并采用调控子分析和TCGA数据库的相关性分析了解BNC1细胞中基因调控网络。通过qPCR和Western Blots实验检测了 ARID5B、AKT和磷酸化AKT的表达水平，在降低BNC1表达的同时使用质粒转染过表达ARID5B重复上述实验。通过双荧光素酶报告实验验证BNC1是否通过转录调控促进ARID5B的表达。<br>　　研究结果<br>　　在scRNA-seq分析中，我们发现了 BNC1可能是促进PTC恶性发展的重要转录因子，且可能在EMT进程中发挥重要作用。生物信息学分析结果显示,BNC1在甲状腺癌组织中表达上调，高表达BNC1与更高的T分期、淋巴结转移和腺外浸润相关，在组织学亚型分析中，经典型和高细胞亚型甲状腺癌中BNC1的表达量明显高于滤泡型。此外，BNC1的表达与肿瘤微环境中免疫细胞的浸润相关。然后，我们发现部分CAF可能来源于BNC1肿瘤细胞，称为EMT-CAF,GJB2 EMPCAF可能在促进细胞外基质重塑和血管形成方面具有重要作用，且在TPC-1细胞中敲减BNC1可以抑制GJB2的表达。最后，我们发现抑制BNC1的表达后,TPC-1细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT受到抑制。调控子分析结果显示 ARID5B、TAGLN2、ETS1和CREB3L1是EMT状态PTC细胞的高特征性和高活性调控子，TCGA数据库的相关性分析显示甲状腺癌中ARID5B与BNC1的表达量正相关，抑制BNC1导致调控子ARID5B表达下调，磷酸化AKT蛋白减少，而在抑制BNC1的同时过表达 ARID5B可以逆转细胞的增殖、迁移、侵袭、EMT以及磷酸化AKT蛋白量的改变。抑制BNC1的表达使含ARID5B启动子载体的荧光减弱。<br>　　研究结论<br>　　scRNA-seq分析以及生物信息学分析提示BNC1可能在EMT进程中发挥重要作用且BNC1表达量与甲状腺癌的T分期、淋巴结转移、腺外浸润和组织学类型相关。BNC1肿瘤细胞可能通过EMT进一步转化为CAF,促进PTC微环境中的细胞外基质重塑和血管形成。细胞实验提示BNC1可能通过转录调控促进ARID5B的表达，进而激活AKT通路促进TPC-1细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT。