摘要目的:探讨深海鱼皮胶原低聚肽粉(Deep sea fish skin collagen oligopeptide powder,FSCP)对肝癌HepG-2细胞凋亡作用及其机制,为FSCP的防治肝癌作用提供理论基础。<br> 方法:1. FSCP对肝癌HepG-2细胞增殖作用的影响:(1)采用MTT法检测FSCP对肝癌HepG-2细胞增殖活性的影响;(2)不同浓度FSCP处理肝癌HepG-2细胞后,采用细胞克隆形成实验测定肝癌HepG-2细胞增殖作用;(3)采用PI单染法检测FSCP对肝癌HepG-2细胞周期的影响;2.采用HE染色法观察FSCP对肝癌HepG-2细胞形态学的影响;3。采用Annexin/PI双染法检测FSCP对肝癌HepG-2细胞凋亡的影响;4. FSCP对肝癌HepG-2细胞线粒体凋亡的影响:(1)采用荧光探针法检测肝癌HepG-2细胞线粒体膜电位改变;(2)通过Western Blotting法检测细胞线粒体凋亡通路相关蛋白的表达;5. FSCP对肝癌HepG-2细胞内质网应激的影响:通过Western Blotting法检测内质网应激通路标志蛋白的表达;6.抑制内质网应激FSCP对肝癌HepG-2细胞凋亡的影响:(1)给予内质网抑制剂4-PBA处理后,采用Annexin/PI双染法检测FSCP对肝癌HepG-2细胞凋亡情况;(2)给予内质网抑制剂4-PBA处理后,通过Western Blotting法检测FSCP对内质网应激通路和线粒体凋亡通路相关蛋白的表达;7.采用划痕愈合实验,检测FSCP对肝癌HepG-2细胞体外迁移能力;采用Transwell小室法,检测FSCP对肝癌HepG-2细胞的体外侵袭能力。<br> 结果:(1)MTT法实验结果显示FSCP可抑制肝癌HepG-2细胞的增殖,并且抑制作用存在时间和浓度依赖性;(2)细胞克隆形成实验结果显示FSCP可抑制肝癌HepG-2细胞形成集落;(3)PI单染法结果显示FSCP诱导肝癌HepG-2细胞阻滞在S期,且与对照组比较,周期相关蛋白p53、p21蛋白表达量显著增加,CDK2和Cyclin A1蛋白表达量显著降低;(4)通过HE染色法染色后肝癌HepG-2细胞间的间距增大,细胞核固缩,核深染,细胞膜皱缩,呈现典型的凋亡形态;(5)Annexin/PI双染法实验结果发现FSCP促进肝癌HepG-2细胞凋亡,且具有浓度依赖性;(6)荧光探针法检测结果发现FSCP作用后肝癌HepG-2细胞线粒体膜电位下降;与对照组比较,各剂量FSCP组细胞中Bax、Cyt-c、Cleaved caspase-3、Caspase-3、Cleaved caspase-9、Caspase-9 和 Cleaved PARP 表达量增加,Bcl-2 表达量降低;(7)与对照组比较,各剂量FSCP组细胞中内质网应激通路相关蛋白GRP78、p-PERK、p-eIF2α、p-IRE1、ATF6、CHOP、p-JNK、Cleaved caspase-12的表达量显著增加;加入内质网抑制剂4-PBA处理后,能够部分逆转FSCP对肝癌HepG-2细胞凋亡作用;(8)FSCP抑制肝癌HepG-2细胞体外迁移和侵袭能力;且相对于对照组,各剂量组FSCP组肝癌HepG-2细胞中MMP2、MMP9的表达量显著降低。<br> 结论:(1)FSCP抑制肝癌HepG-2细胞增殖,阻滞肝癌HepG-2细胞于S期。(2)FSCP激活肝癌HepG-2细胞内质网应激信号通路,并介导诱发线粒体凋亡。(3)FSCP抑制肝癌HepG-2细胞迁移和侵袭能力。
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