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摘要胃癌(Gastric Cancer,GC)是一种高致残率、高致死率的恶性肿瘤，对人们的生命安全造成了极大的威胁。目前胃癌的治疗主要以手术、放化疗为主。前期研究发现，中药可降低肿瘤患者的化疗毒副作用，提高患者的生活质量，缓解临床症状，提高患者的生存率。近年来，中药抗癌作用日益引起人们的重视。黄芩素(baicalein,BAI)是一种广谱的中药，具有显著的抗菌、抗肿瘤、抗过敏和抗氧化等功效。MicroRNAs(miRNAs)是一种长度在20-25个碱基之间，具有调节作用的内源性非编码RNA,在调节细胞生长和疾病中有非常重要的作用。MicroRNA-7(miR-7)是进化上高度保守的miRNA,其在胃癌中表达水平较低。课题组前期研究表明，BAI可抑制胃癌细胞增殖和迁移等生物学功能,并上调miR-7在胃癌细胞中的表达;BAI也可通过调控miR-7抑制胃癌细胞的血管生成并诱导自噬体形成，其作用机制与MAPK/ERK信号通路的活化密切相关。但是BAI通过调控miR-7对胃癌细胞周期和凋亡的影响尚无报道，其作用机制是否与PI3K/AKT/mTOR信号通路相关也有待研究。因此，本论文旨在研究BAI通过调控miR-7对胃癌细胞凋亡和周期的影响及其分子机制，以及这种影响是否通过介导PI3K/AKT/mTOR信号通路发生，从而为抗肿瘤中药BAI的开发应用奠定实验基础。<br>　　目的:探讨BAI调控miR-7介导PI3K/AKT/mTOR信号通路对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡和周期的分子机制研究。<br>　　方法:1.材料:本实验采用延边大学肿瘤研究中心的人胃癌细胞系SGC-7901和BGC-823为实验对象。2.方法:(1)慢病毒转染实验:建立miR-7低表达的胃癌SGC-7901细胞和BGC-823细胞稳定转染的细胞系。（2）qRT-PCR实验:验证慢病毒转染后在胃癌细胞SGC-7901和BGC-823中的miR-7 inhibitor的转染效果。（3）CCK8、克隆形成实验:观察miR-7低表达及其与BAI结合对胃癌细胞增殖的影响。（4）划痕修复及Transwell实验:观察miR-7低表达及其与BAI结合对胃癌细胞的迁移和侵袭的影响。（5）免疫荧光染色:检测miR-7低表达及其与BAI结合对胃癌细胞的EMT相关蛋白表达的影响。（6）流式细胞术:Annexin Ⅴ-FITC/PI双染色法:观察miR-7低表达及其与BAI结合对胃癌细胞凋亡的作用。（7）Hoechst33342染色:观察miR-7低表达及其与BAI结合对胃癌细胞核形态的变化，及对细胞凋亡的作用。（8）Western blot实验:测定miR-7低表达及其与BAI结合对胃癌细胞PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白、EMT相关蛋白、细胞凋亡及细胞周期相关蛋白表达及磷酸化蛋白水平的影响。<br>　　结果:1.qRT-PCR实验:慢病毒转染后 SGC-7901/miR-7 inhibitor 组和 BGC-823/miR-7 inhibitor组的miR-7表达水平与对照组比较明显降低（均P＜0.01）。2.CCK8及克隆形成实验:miR-7低表达组胃癌细胞的增殖活性较对照组显著增强，miR-7低表达组胃癌细胞经BAI干预后，其增殖活性显著降低（均P＜0.01）。3.划痕修复及Transwell迁移及侵袭实验:miR-7低表达组胃癌细胞的迁移及侵袭能力较对照组显著增强，miR-7低表达组胃癌细胞经BAI干预后，其迁移及侵袭能力则显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。4.免疫荧光染色:miR-7低表达组胃癌细胞EMT标志物中E-cadherin的表达降低，Vimentin的表达升高，而miR-7低表达组经BAI干预后EMT标志物中E-cadherin的表达反而升高，Vimentin的表达反而降低（P＜0.05或P＜0.01）。5.流式细胞术:Annexin Ⅴ-FITC/PI双染色法检测表明:miR-7低表达组的胃癌细胞凋亡率明显下降，miR-7低表达组胃癌细胞经BAI干预后，胃癌细胞的凋亡率反而会增加（P＜0.05或P＜0.01）。6.Hoechst33342染色:miR-7低表达组细胞的细胞核呈均匀的蓝色荧光，无亮蓝色的凋亡小体;而miR-7低表达组胃癌细胞经BAI干预后，BAI用药组细胞明显出现了亮蓝色的凋亡小体（P＜0.05或P＜0.01）。7.蛋白印迹实验:（1）miR-7低表达组胃癌细胞的E-cadherin蛋白的表达量降低，Vimentin、Snail、MMP9和MMP2蛋白的表达量增加（P＜0.05或P＜0.01）;而在miR-7低表达组胃癌细胞经BAI干预后,E-cadherin蛋白的表达明显升高,而Vimentin、Snail、MMP9和MMP2蛋白的表达显著降低（均P＜0.01）;（2）miR-7低表达组胃癌细胞下调了凋亡相关蛋白Bax、Cleaved-PARP、Cleaved-caspase 3的表达，而上调了 Bcl-2蛋白的表达（P＜0.05或P＜0.01）;而miR-7低表达组胃癌细胞经BAI干预后，反而上调了胃癌细胞凋亡相关蛋白Bax、Cleaved-PARP、Cleaved-caspase 3的表达，而下调了 Bcl-2蛋白的表达（均P＜0.01）;（3）miR-7低表达组胃癌细胞中与细胞周期G0/G1期密切相关的CDK6、CDK4和CyclinD1蛋白表达上调，p21表达下调（P＜0.05或P＜0.01）,而miR-7低表达组胃癌细胞经BAI干预后，G0/G1期关键蛋白CDK6、CDK4和CyclinD1的表达下降，p21蛋白的表达上升（均P＜0.01）;（4）miR-7低表达组胃癌细胞中PI3K/AKT/mTOR信号通路密切相关的PI3K、AKT、mTOR蛋白磷酸化水平上升，而与之相对应的总蛋白表达水平没有显著改变（P＜0.05或P＜0.01）;而miR-7低表达组胃癌细胞经BAI干预后，却能抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路中PI3K、AKT、mTOR的磷酸化,但与之相对应的总蛋白表达并没有显著改变（P＜0.05或P＜0.01）。<br>　　结论:（1）BAI对人胃癌细胞SGC-7901、BGC-823有明显的抑制作用;（2）miR-7低表达的胃癌细胞经BAI干预后，其增殖、迁移、侵袭、EMT过程受到明显的抑制，细胞凋亡增加，影响细胞周期进程;（3）BAI对miR-7的调节作用可能与其对PI3K/AKT/MTOR信号通路途径的调节有关。