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摘要目的:在中国，患有慢性肝病患者人数已经超过4亿以上，其中肝纤维化人数约占17％以上。纤维化相关的肝硬化和肝癌是慢性肝病死亡率不断上升的主要原因，而肝纤维化是缓解和治疗肝硬化和肝癌的关键阶段，但是目前在临床治疗上仍缺乏可以明显改善肝纤维化的药物。本实验通过研究噻唑类衍生物激活素受体样激酶5(Activinreceptor-likekinase5,ALK5)小分子抑制剂的两个旋光异构体J-1155和J-1156对肝纤维化的治疗作用及其差异，从而筛选出能够改善肝纤维化，可用于临床治疗的候选药物。<br>　　方法:1.体外实验:通过MTT实验检测J-1155和J-1156在0-100μM的浓度下对人肝星状细胞(LX-2)活力的影响，筛选出其体外给药剂量;将LX-2细胞加入不同剂量(5、10和20μM)的J-1155和J-1156以及阳性对照药物LY-2157299(5μM)孵育细胞1小时后，加入TGF-β(5ng/mL)刺激细胞24小时。通过Westernblot实验测定其细胞总蛋白中α-SMA、TypeⅠCollagen、TGF-βRI、Smad2/3、P-Smad2/3、Smad4、Smad7、Smurf1和Smurf2蛋白表达水平和差异。并通过细胞免疫荧光实验进一步验证α-SMA、TypeⅠCollagen和Smad7的Westernblot的实验结果。<br>　　2.体内实验:通过对C57BL/6雄性小鼠进行不同剂量(12.5、25和50mg/kg)J-1155和J-1156的持续8天灌胃给药的毒理学实验后，对其体重变化、血清生化指标(ALT和AST)和肝、肾组织病理学的H&E染色进行分析，从而筛选出合适的体内给药剂量。<br>　　TAA所致小鼠肝纤维化模型:通过对C57BL/6雄性小鼠腹腔注射TAA的方法建立肝纤维化模型。在造模的最后2周，给予肝纤维化小鼠不同剂量(25和50mg/kg)的J-1155和J-1156以及阳性药物LY-2157299(50mg/kg)进行治疗。通过对小鼠肝脏形态学、肝重指数、血清生化指标(ALT和AST)对肝纤维化小鼠的肝损伤情况进行分析;通过H&E染色、SiriusRed染色、Masson染色和免疫组织化学(Fibronectin)染色观察肝纤维化小鼠肝脏的病理损伤和胶原纤维沉积的程度;通过Westernblot实验、RT-PCR实验和组织免疫荧光实验检测肝脏组织中的α-SMA、TypeⅠCollagen等肝纤维化标志物蛋白的表达;通过Westernblot实验测定TGF-βRI、Smad2/3、P-Smad2/3、Smad4和Smad7蛋白的表达，进而确定J-1155和J-1156对TGF-β/Smad通路的干预作用;通过Westernblot实验和免疫组织化学染色对小鼠肝脏中P2X7R、NLRP3、ProIL-1β、matureIL-1β、MPO和F4/80蛋白的表达进行测定，以分析J-1155和J-1156在肝纤维化进程中对免疫细胞和炎症反应的影响。<br>　　结果:1.体外实验:MTT结果显示只有J-1156在100μM的浓度下会对LX-2细胞具有明显的毒性;Westernblot实验、RT-PCR实验和细胞免疫荧光实验结果表明J-1155和J-1156均能明显抑制TGF-β刺激所导致的LX-2细胞活化，并降低其α-SMA、TypeⅠCollagen、TGF-βRI和P-Smad2/3蛋白的表达，上调Smad7、Smurf1和Smurf2的蛋白表达至正常水平，而Smad2/3和Smad4的表达水平并没有明显的变化。J-1156抑制α-SMA、TypeⅠCollagen、TGF-βRI、P-Smad2/3和上调Smad7表达的效果优于J-1155,而J-1155调控Smurf2的表达要优于J-1156。<br>　　2.体内实验:J-1155和J-1156高、中、低给药组中的小鼠无明显毒性反应且存活率为100％;小鼠的肝脏形态学正常，肝脏和肾脏的H&E染色均没有明显病理性变化，ALT和AST的水平也与正常组小鼠相比无明显差异。<br>　　TAA所致小鼠肝纤维化模型:肝脏的H&E染色、ALT和AST指标的结果表明J-1155和J-1156均可显著改善TAA诱导的肝损伤;Siriusred染色、Masson染色和免疫组织化学(Fibronectin)染色表明J-1155和J-1156能明显改善TAA诱导小鼠的肝纤维化，缓解肝脏中胶原纤维的蓄积;Westernblot实验、RT-PCR实验和组织免疫荧光实验结果表明J-1155和J-1156可以抑制肝脏中ECM(α-SMA、TypeⅠCollagen)的表达，同时也可以调控TGF-β/Smad信号通路相关蛋白，抑制TGF-βRI、P-Smad2/3蛋白的表达并上调Smad7、Smurf1和Smurf2的水平，此外，Westernblot实验和免疫组织化学(F4/80和MPO)染色实验表明J-1155和J-1156可以降低P2X7R、NLRP3和IL-1β表达，并抑制免疫细胞的大量募集。<br>　　结论:噻唑类衍生物ALK5小分子抑制剂—J-1155和J-1156可以通过抑制ALK5(TGF-βRI)进而干预TGF-β/Smad信号通路传导，抑制了HSCs的活化以及ECM的沉积;J-1156可通过干预P2X7R-NLRP3信号轴，减少了IL-1β等炎症因子释放;J-1155、J-1156可以抑制巨噬细胞和中性粒细胞的募集，减缓进行性肝纤维化的发生;J-1156在抗纤维化方面的整体治疗作用优于J-1155,而J-1155对于Smurf2的调节作用优于J-1156。ALK5抑制剂J-1155和J-1056均有望成为抗肝纤维化的潜在候选药物。