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摘要目的:<br>　　动脉粥样硬化(AS)是心血管病疾病的基础，内皮细胞时血管壁内层的一种细胞，它的主要功能是调节血管收缩，调节血液凝固，维持血管内皮屏障，参与免疫调节和炎症反应，在一些病理条件下，内皮细胞正常功能受到损伤，这种功能紊乱会促进动脉粥样硬化发展。当内皮细胞功能受损时表达单核细胞趋化蛋白(MCP-1)、白细胞介素(IL-1)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管黏附分子-1(VCAM-1)、E选择素(E-selectin)和其他炎症因子，这些细胞因子导致内皮细胞内膜通透性增加，内膜下活性氧增多，进一步导致低密度脂蛋白氧化为氧化低密度脂蛋白ox-LDL,ox-LDL进一步刺激内皮细胞，导致内皮细胞功能紊乱，血管壁易受损，容易形成动脉粥样硬化斑块，因此维持内皮细胞功能正常对于预防和治疗动脉粥样硬化疾病具有重要意义。然而尽管在内皮细胞功能紊乱的研究领域已经有了很多进展，但当下仍存在一些研究的不足。因此基于血管内皮细胞功能紊乱这一体外AS早期模型研究早期诊断标志物和开发药物靶点有助于在AS早期进行防治。<br>　　本文通过基因芯片发现MS4A6A基因在患者的动脉粥样硬化斑块中高表达，生信分析、AS患者斑块免疫组化和AS模型鼠免疫组化发现升高，提示该蛋白可能在动脉粥样硬化起着一定作用。因此本研究拟通过ELISA、血管内皮细胞功能紊乱模型、细胞活性氧检测、单核细胞粘附、等实验观察观察MS4A6A蛋白在内皮细胞功能紊乱中的影响和具体机制，为MS4A6A蛋白作为潜在AS标志物和AS防治提供理论基础。<br>　　方法:<br>　　第一部分<br>　　1.芯片筛查差异表达基因:通过mRNA芯片寻找动脉粥样硬化患者斑块组织与正常动脉内膜组织中差异表达基因，结果发现MS4A6A基因在斑块组织中表达上调。<br>　　2.临床斑块组织层面观察MS4A6A蛋白表达:收集3例人动脉粥样硬化斑块组织，通过HE染色和MASSON染色结果对切片的病变程度进行分型，分型按照美国心脏病协会(American Heart Association,AHA)的斑块分型规则进行分型Ⅰ-Ⅳ期，随后对分型的切片进行免疫组织化学染色观察MS4A6A蛋白的表达水平。<br>　　3.动物AS模型观察蛋白表达:构建基于apoE基因敲除(apoE-/-）小鼠的AS模型，ApoE-/小鼠-在通过16周高脂饮食诱导后，对小鼠进行器官取材，取小鼠的心脏包埋切片，对小鼠的主动脉窦斑块组织进行油红与马松染色观察AS模型构建是否成功，之后进行免疫组织化学染色，检测MS4A6A蛋白在主动脉窦斑块组织的表达情况。<br>　　4.初步探讨血清中MS4A6A蛋白是否具有生物标志物的潜力:收集广东省中医院2022-2023年60例AS心血管疾病患者以及体检表观健康者的血清，按照疾病类型分为四组，分别为健康人组，心绞痛组，心梗组，心衰组。采用酶联免疫法检测血清中MS4A6A蛋白的表达水平。<br>　　第二部分<br>　　1.利用ox-LDL诱导的血管内皮功能紊乱细胞模型，观察MS4A6A蛋白表达变化<br>　　(1)分别用 0、25、50、75、100μg/mL ox-LDL 刺激 HUVEC24h,蛋白质免疫印迹法检测细胞中MS4A6A蛋白的表达情况<br>　　(2)用75μg/mL ox-LDL刺激HUVEC0、24、48h,蛋白质免疫印迹法检测细胞中MS4A6A蛋白表达情况。<br>　　2.MS4A6A蛋白介导ox-LDL诱导的细胞功能紊乱<br>　　(1)单核细胞粘附实验观察蛋白对单核粘附的影响:内皮细胞转染MS4A6A小干扰RNA片段，75μg/mL ox-LDL刺激HUVEC24小时后，单核细胞黏附实验观察单核细胞黏附聚集是否增加。从而观察MS4A6A蛋白是否参与ox-LDL诱导HUVEC功能紊乱这一过程。<br>　　（2）蛋白免疫印迹法观察蛋白对粘附相关蛋白的影响:内皮细胞转染MS4A6A小干扰RNA片段后，75μg/mL ox-LDL刺激HUVEC 24小时后，提取细胞蛋白，免疫印迹法检测MS4A6A、ICAM-1、VCAM-1蛋白的表达变化。<br>　　(3)荧光定量PCR观察蛋白对炎症相关因子的影响:内皮细胞转染MS4A6A小干扰RNA片段后，75μg/mL ox-LDL刺激HUVEC 24小时后，提取细胞RNA,荧光定量PCR检测IL-1β、IL-6、TNF-α炎症因子RNA的表达变化。<br>　　(4)流式细胞仪观察蛋白对胞内ROS水平的影响:内皮细胞转染MS4A6A小干扰RNA片段后，75μg/mL ox-LDL刺激HUVEC24小时后，细胞流式检测细胞内活性氧ROS变化。<br>　　第三部分<br>　　1.探讨MS4A6A蛋白是否通过NF-κB通路介导ox-LDL对HUVEC功能紊乱的调控及具体机制<br>　　（1）蛋白免疫印迹法观察MS4A6A蛋白对NF-κB通路的影响:内皮细胞转染MS4A6A 小干扰 RNA 片段后，100 μg/mL ox-LDL 刺激 HUVEC 30、60 min 后，检测NF-κB 通路蛋白 IKKα/β、p-IKKα/β、IKB-α、p-IKB-α、P65、p-P65 等的表达情况。<br>　　（2)蛋白免疫印迹法明确MS4A6A蛋白对NF-κB的影响:内皮细胞转染MS4A6A小干扰RNA片段后，NF-κB通路抑制剂Bay11-7085预处理1h,75μg/mL ox-LDL刺激HUVEC 24小时，免疫印迹法检测MS4A6A、ICAM-1、VCAM-1蛋白的表达变化。<br>　　（3）荧光定量PCR明确MS4A6A蛋白对NF-κB下游炎症的影响:内皮细胞转染MS4A6A小干扰RNA片段后，NF-κB通路抑制剂Bay11-7085预处理1h,75μg/mL ox-LDL刺激HUVEC 24小时后，提取细胞RNA,荧光定量PCR检测IL-1β、IL-6、TNF-α炎症因子RNA的表达变化。<br>　　（4）蛋白免疫印迹法明确MS4A6A蛋白具体影响NF-κB通路的机制:内皮细胞转染MS4A6A,IKK蛋白小干扰RNA片段后，75μg/mL ox-LDL刺激HUVEC 24小时，之后提取细胞蛋白，免疫印迹法检测MS4A6A、ICAM-1、VCAM-1蛋白的表达变化<br>　　（5）功能挽救实验:内皮细胞转染MS4A6A,IKK蛋白小干扰RNA片段后，75μg/mL ox-LDL刺激HUVEC 24小时后，单核细胞黏附实验观察单核细胞黏附聚集情况变化。<br>　　结果:<br>　　第一部分<br>　　1.基因芯片结果显示相比于正常动脉组织，MS4A6A基因在斑块组织中表达上调。<br>　　2.免疫组织化学染色结果显示，随着斑块组织分型的提高，MS4A6A蛋白在斑块组织中的表达逐渐升高。<br>　　3.ApoE-/-小鼠主动脉窦的免疫组化结果显示，在动脉粥样硬化模型组中MS4A6A蛋白表达较对照组小鼠明显升高。<br>　　4.酶联免疫法结果显示在AS导致的心脏病患者中，血清MS4A6A蛋白含量明显高于正常健康人群。<br>　　第二部分<br>　　1.MS4A6A蛋白表达随ox-LDL浓度与时间依赖性提高，在ox-LDL浓度为75μg/mL和刺激时间为24h时，提高最为明显。<br>　　2.75μg/mL ox-LDL刺激HUVEC24h,荧光定量PCR和免疫印迹法结果显示，HUVEC炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的RNA表达明显升高，黏附因子ICAM-1、VCAM-1的蛋白的表达量也明显升高。单核细胞黏附实验显示在ox-LDL刺激后，单核细胞黏附增多。细胞流式仪结果显示细胞内活性氧明显增多。<br>　　3.敲减MS4A6A蛋白表达后，ox-LDL诱导HUVEC上调的黏附因子ICAM-1、VCAM-1的蛋白表达受到抑制，上调的炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的RNA表达也受到抑制上，单核黏附实验黏附增多的单核细胞数量受到抑制。<br>　　第三部分<br>　　1.75μg/mL ox-LDL刺激HUVEC 30和60min后通过免疫印迹法可以明显看出MS4A6A 介导了 ox-LDL 对 NF-κB 通路的激活，p-IKKα/β、p-IKB-α、p-P65 蛋白表达明显升高，但在通过小干扰RNA干扰MS4A6A蛋白表达后，上调的相关磷酸化通路蛋白表达被抑制。<br>　　2.NF-κB 通路抑制剂 Bay11-7085 预处理后，敲减 MS4A6A 对 75μg/mL ox-LDL诱导的黏附因子ICAM-1、VCAM-1和炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达无影响。<br>　　3.抑制IKK蛋白在血管内皮细胞中的表达，可以明显抑制ox-LDL诱导的内皮细胞功能紊乱，且同时敲减IKK蛋白与MS4A6A蛋白与单独敲减IKK蛋白相比，抑制程度并未增加。<br>　　总结:<br>　　1.MS4A6A蛋白在动脉粥样硬化组织中以及血清中表达上调，具有成为动脉粥样硬化生物标志物的潜力。<br>　　2.敲减HUVEC中MS4A6A蛋白的表达可以挽救ox-LDL诱导的内皮细胞功能紊乱。<br>　　3.MS4A6A蛋白通过激活NF-κB通路介导ox-LDL诱导的内皮细胞功能紊乱。<br>　　4.MS4A6A蛋白通过激活IKK蛋白从而激活NF-κB通路，从而介导ox-LDL诱导的内皮细胞功能紊乱。