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摘要1.目的<br>　　海南砂(Wurfbainialongiligularis)属姜科豆蔻属植物，是中药砂仁的药用植物来源之一，其干燥成熟果实含有丰富的挥发油，如乙酸龙脑酯、樟脑、龙脑等萜类化合物。龙脑脱氢酶(borneoldehydrogenase,BDH)来源于短链脱氢/还原酶(short-chaindehydrogenases/reductases,SDR)超家族，能催化龙脑生成樟脑，是樟脑合成途径下游最后的关键酶，其他植物中也已有龙脑脱氢酶的报道，而海南砂中的龙脑脱氢酶基因及其相应的基因家族未被报道。海南砂与阳春砂种子中皆含有较丰富的樟脑，但二者相比，海南砂的樟脑含量在总萜类化合物中占比高于阳春砂樟脑含量的占比，并且樟脑在海南砂各组织部位中的分布更广，对其合成途径中关键酶龙脑脱氢酶的研究有利于深入认识海南砂中樟脑的合成和调控机制，同时比较二者龙脑脱氢酶差异有利于进一步探究阳春砂和海南砂龙脑相关萜类含量差异的原因。因此,本研究基于海南砂基因组的基因挖掘和体外酶反应,鉴定WlBDH,尤其是参与种子中樟脑合成的关键龙脑脱氢酶，并与阳春砂龙脑脱氢酶WvBDH进行比较，通过分析它们的功能和结构差异，阐释其与樟脑含量占比差异的关系。<br>　　2.方法<br>　　2.1海南砂SDRclassical家族全基因组水平的生物信息学分析<br>　　基于海南砂全基因组序列，通过本地BLAST和Pfam蛋白数据库的登记号并结合隐马尔可夫模型(hiddenMarkovmodels,HMM)搜索结果，筛选海南砂SDRclassical家族成员，用SDREnzymes对获得的上述成员进行分组;对该家族进行染色体定位和共线性分析;结合代谢组和转录组，关注主要的樟脑积累器官以及在不同组织部位的积累趋势;结合进化树分析，获得候选基因。<br>　　2.2WlBDH候选基因的克隆与功能鉴定<br>　　以候选基因表达量高的部位cDNA为模板，克隆候选的WlBDH基因，并构建重组表达载体，进行原核表达、融合蛋白诱导和纯化;以(+)-龙脑(海南砂内源底物)以及其相反构型龙脑和其他单萜醇为底物，进行体外酶促反应;使用GC-MS检测其催化产物。<br>　　2.3WlBDH和WvBDH表达模式分析<br>　　设计相应的用于qPCR的引物，以海南砂7个不同组织部位(包括种子团、果皮、叶、花、茎、根状茎和根)以及阳春砂种子团的cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR。同时运用PlantCARE对启动子进行预测分析并将结果可视化。<br>　　2.4WlBDH和WvBDH酶动力学分析<br>　　以（+）-龙脑为底物，运用紫外分光光度法，对WlBDH和WvBDH进行酶动力学分析和比较。<br>　　2.5WlBDH同源建模与分子对接<br>　　以鼠尾草龙脑脱氢酶SoBDH2为模板对阳春砂和海南砂的龙脑脱氢酶进行同源建模，比较两者蛋白结构差异;运用Autoduckvina,与右旋龙脑为底物进行分析对接，分析对接结果，比较催化中心关键氨基酸位点的差异。<br>　　3.结果<br>　　3.1海南砂SDRclassical家族成员的鉴定及候选基因筛选<br>　　从海南砂基因组中鉴定了109个SDRclassical家族成员，共分为21个亚家族。通过染色体定位和共线性分析，发现海南砂SDRclassical家族通过片段复制和串联复制进行家族的扩展。从龙脑脱氢酶归属的SDR110C亚家族中筛选在种子团中高表达以及与WvBDH聚类关系相近的候选基因，筛选出其中10个基因为WlBDH候选基因，包括9个SDR110C和1个SDR132C亚家族成员。<br>　　3.2WlBDH候选基因的克隆与功能鉴定<br>　　10个WlBDH候选基因均被克隆并获得了其融合蛋白，其中只有7个WlSDR110C经鉴定具有龙脑脱氢酶的功能，分别命名为WlBDH1、WlBDH2、WlBDH3、WlBDH4、WlBDH5、WlBDH6和WlBDH7。这7个WlBDH均能催化（+）-龙脑生成（+）-樟脑，并且与以（-）-龙脑为底物时相比，均对（+）-龙脑具有更好的催化活性或者只对（+）-龙脑具有催化活性，其中WlBDH2催化活性最好;同时它们还能够催化其它单萜醇，具有一定的底物宽泛性。依据课题组前期对海南砂果实内源龙脑和樟脑构型的检测和分析结果，两者均为右旋构型,与上述WlBDH体外酶活对（+）-龙脑的偏好性一致。<br>　　3.3WlBDH表达模式分析及其与WvBDH的比较<br>　　WlBDH2在种子团特异表达且表达量最高，而WlBDH3和WlBDH4则是在根、根状茎和茎具有较高表达。因此，推测WlBDH2主要负责种子团中樟脑的合成，而WlBDH3和WlBDH4则参与根、根状茎和茎中樟脑的合成，这与樟脑在海南砂的茎、根状茎及根中均有分布相符。以60DAF果实的种子团为实验材料，WvBDH2、WvBDH3与WlBDH2、WlBDH4相比,WvBDH2表达量最高，WlBDH2次之。启动子分析发现海南砂和阳春砂BDH含有不同数量的胁迫反应相关元件。<br>　　3.4WlBDH酶学特性分析及其与阳春砂WvBDH的比较<br>　　以（+）-龙脑为底物的酶动力学实验结果表明,WlBDH2的Vmax、Km、kcat、kcat/Km值均高于其它3个BDH,WlBDH3与WvBDH2序列相似性最高，其Vmax、kcat值高于WvBDH2,表明WlBDH2、WlBDH3对（+）-龙脑具有更好的催化活性。这与海南砂种子团的樟脑百分比含量高于阳春砂的结果一致。<br>　　3.5WlBDH2结构分析、分子对接及其与WvBDH2的比较<br>　　WlBDH2与WvBDH2蛋白结构具有较高的重叠性，它们催化活性中心高度重叠，但在结合口袋外围有一个明显的二级构造差异，这个结构差异可能是二者功能差异的分子基础之一。以右旋龙脑为配体小分子，通过分子对接，结果显示与底物结合相关的9个非保守氨基酸位点中只有1个差异位点，分别为精氨酸R184和甘氨酸G182,推测这个位点可能为决定龙脑脱氢酶催化活性的关键位点。<br>　　4.结论<br>　　本研究从海南砂SDRclassical家族成员中鉴定了7个SDR110C成员具有龙脑脱氢酶的功能。7个WlBDH均对(+)-龙脑表现出偏好性，其中WlBDH2对(+)-龙脑的催化活性最好，且WlBDH2在种子团中高表达，是海南砂种子团中参与樟脑合成的关键酶。虽然WlBDH2催化效率高于WvBDH2,但在种子团中的表达量低于WvBDH2。WlBDH2与WvBDH2虽然蛋白结构高度相似，但结合口袋外围的结构差异及其与底物结合相关的1个差异氨基酸位点可能影响了二者的催化活性。本研究为砂仁两种来源植物的樟脑含量差异提供了基于龙脑脱氢酶差异的解释，为砂仁品质相关的分子育种提供了参考。