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摘要目的:<br>　　溃疡性结肠炎(Ulcerativecolitis,UC)是一种慢性非特异性结肠炎症，属临床难治性疾病之一，目前认为肠道免疫稳态被打破所导致的肠道免疫紊乱在UC的发生发展中起重要作用。研究发现调节性T细胞(RegulatoryTcells,Tregs)在维持机体肠道免疫稳态中发挥重要作用，Treg细胞数量或功能异常与UC发病密切相关，而PTEN/PI3K/AKT/mTOR是调节Treg稳态的重要通路之一。课题组前期工作发现miR-29a在UC中呈高表达;而磷酸酯酶与张力蛋白同源物(PhosphataseandTensinHomolog,PTEN)为miR-29a的靶基因。因此，在UC发病过程中，miR-29a/PTEN/PI3K的异常变化可能会影响Treg细胞的平衡状态，引起肠道免疫功能紊乱，促使疾病的发生。美洲大蠊(Periplanetaamericana,PA)对UC具有良好的疗效，然而其深入的分子生物学机制尚未探明。最新研究指出美洲大蠊可以通过PTEN/PI3K通路治疗溃疡性疾病，因此，本研究拟进一步明确美洲大蠊提取物治疗UC的作用，探讨其是否通过调控miR-29a/PTEN/PI3K恢复Treg细胞稳态进而治疗UC的分子机制。<br>　　方法:<br>　　利用3％葡聚糖硫酸钠(Dextransulfatesodium,DSS)诱导UC小鼠模型，在7天造模同时，按分组给予美沙拉嗪及低、中、高剂量美洲大蠊提取物溶液灌胃干预。造模期间，观察记录小鼠的一般体征状态，对小鼠进行疾病活动指数(Diseaseactivityindex,DAI)评分。造模结束禁食24h后，对小鼠进行摘眼球取血并剖取结肠，测量记录结肠长度、重量，结肠组织经苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosinstaining,HE)后镜下观察肠道损伤及炎症浸润情况。采用ELISA检测血清及结肠组织中IL-1β、IFN-γ、IL-10、TGF-β及MPO的水平;采用RT-qPCR检测结肠组织中miR-29a、PTEN及PI3K信号通路相关基因的表达水平;采用WesternBlot(WB)检测结肠组织中PTEN及PI3K信号通路相关蛋白的表达水平;采用流式细胞术检测各组小鼠脾脏中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的数量比例。<br>　　结果:<br>　　1.与正常组小鼠对比，造模组小鼠的体重及进食量随时间变化逐渐下降，DAI评分逐渐上升，部分造模组小鼠会出现明显的肛门污秽突出或带血，并伴有活动减少、排稀便、血便等症状。经过给药处理后，美洲大蠊中、高剂量组小鼠的便血症状较模型组减轻，DAI评分低于模型组(P＜0.05)。提示DSS诱导UC模型构建成功，且美洲大蠊提取物的干预可以缓解UC小鼠症状。<br>　　2.相对于正常组，造模组小鼠的结肠长度缩短(P＜0.01),单位长度结肠重量增加(P＜0.01),其中以模型组和美洲大蠊低剂量组最明显;而与模型组对比，美洲大蠊中、高剂量组结肠长度均有所增加(P＜0.05),美洲大蠊高剂量组的单位长度结肠重量也有降低，但差异无统计学意义（P=0.295）。<br>　　3.HE染色镜下观察结果显示，正常组小鼠结肠黏膜层上皮细胞的形态和结构完整，隐窝分布均匀，存在大量杯状细胞，未见明显的炎症;而模型组小鼠结肠黏膜层可见大量炎性细胞浸润，以淋巴细胞为主，隐窝大小、形态出现不规则改变，隐窝排列紊乱，杯状细胞减少;经过美洲大蠊提取物的干预，可见炎性细胞的浸润减少，隐窝结构有所恢复，杯状细胞的数量有所恢复。<br>　　4.ELISA结果显示，与正常组相比，模型组小鼠血清中IL-1β和IFN-γ水平升高（P＜0.01）,IL-10水平降低（P＜0.01）,结肠中IL-1β、IFN-γ和IL-10水平升高，但差异无统计学意义（P=0.268、0.408、0.540）;与模型组相比，经美洲大蠊处理后，血清中IL-1β和IFN-γ水平下降（P＜0.01）,血清IL-10水平升高（P＜0.01）,结肠组织中MPO和IL-10水平降低（P＜0.01）。该结果提示，给予美洲大蠊提取物干预后,在一定程度上能抑制血清及结肠组织中促炎因子的分泌，同时促进抗炎因子的表达。<br>　　5.PCR结果显示，模型组小鼠结肠组织中miR-29a的表达相较于正常组的显著升高（P＜0.01）,在给予美洲大蠊提取物干预后，三个剂量组miR-29a的表达水平均有所下降且呈剂量依赖性，其中以高剂量组降低最明显（P＜0.01）;与正常组相比较，模型组中PTEN的mRNA表达水平明显降低（P＜0.01）,经美洲大蠊干预后PTEN的mRNA表达比模型组稍有回升。对于PI3K通路相关基因的表达水平，与正常组相比,模型组中PI3K的mRNA表达水平明显升高（P＜0.01）,AKT和mTOR的mRNA表达水平明显降低（P＜0.01）;与模型组相比，美洲大蠊低剂量组中PI3K的mRNA表达没有明显变化，而美洲大蠊中、高剂量组中PI3K的mRNA表达显著降低（P＜0.05）。此外，美洲大蠊三个剂量组和模型组间AKT和mTOR的表达差异无统计学意义。上述结果提示，经过美洲大蠊干预后UC小鼠体内miR-29a的表达水平确实有所下降，但美洲大蠊对PTEN/PI3K通路相关基因的表达影响不明显，可能是miR-29a对靶基因的转录后调控作用。<br>　　6.WB结果显示，与正常组相比，模型组中PTEN的蛋白表达水平明显下降（P＜0.01）,而p-PI3K、p-AKT和p-mTOR的蛋白表达水平明显上升（P＜0.01）。给药处理后，美洲大蠊高剂量组PTEN蛋白表达水平较模型组明显升高（P＜0.01）,各给药组p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表达水平较模型组均有降低的趋势，以美洲大蠊中、高剂量组变化明显（P＜0.05或P＜0.01）。PI3K通路相关的磷酸化蛋白变化明显,提示美洲大蠊的干预对PI3K/AKT/mTOR通路有影响。<br>　　7.流式细胞术结果显示，相较于正常组，模型组小鼠脾脏Treg细胞比例减低（P＜0.01）;相较于模型组而言，美洲大蠊高剂量组Treg细胞比例有所恢复（P＜0.01）。由此推测美洲大蠊提取物可以通过促进Treg细胞数量增长，恢复机体的免疫调节稳态以抵抗DSS诱导UC病情进展。<br>　　结论:<br>　　本研究表明美洲大蠊提取物能有效缓解UC小鼠的症状及病理状态，以美洲大蠊高剂量组的疗效最显著;它的作用机制可能是通过调控miR-29a/PTEN/PI3K轴以恢复Treg细胞水平并对相关细胞因子进行有利调节来实现的。