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摘要目的:<br>　　1 从成骨细胞/破骨细胞维持的骨平衡的体系研究杨梅苷抗骨质疏松的药理作用以及探究可能的靶向机制;<br>　　2 从动物实验方面构建小鼠去卵巢(OVX)骨质疏松模型，探究杨梅苷对OVX小鼠骨组织骨代谢相关基因和蛋白表达的影响，验证杨梅苷抗骨质疏松作用可能的靶向机制。<br>　　方法:<br>　　1 细胞研究<br>　　(1)从小鼠长骨提取获得并永生化处理的骨髓间充质干细胞(immortalized mouse bone marrow mesenchymal stem cells,imBMSCs)利用 CCK-8 检测不同浓度的杨梅苷对细胞的活力影响;对imBMSCs进行成骨分化诱导，诱导后进行碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性定量及染色;诱导后进行茜素红染色检测;qPCR和Western blot分析杨梅苷对成骨分化相关基因和蛋白表达的影响。<br>　　(2)为了进一步探究杨梅苷促进imBMSCs成骨分化的作用机制，提取RNA并做了高通量转录组测序，并对转录组测序结果进行KEGG以及GO富集分析;通过之前对测序结果分析，发现PI3K/AKT信号通路参与了成骨分化的调控，并通过分子对接、蛋白互作(PPI)网络分析以及Western blot进行验证。<br>　　(3)为了进一步验证PI3K/AKT信号通路在杨梅苷促进成骨分化的作用，我们使用PI3K抑制剂库潘尼西进行rescue实验进行验证;利用CCK-8检测不同浓度的库潘尼西对细胞的活力影响;利用筛选出库潘尼西和杨梅苷对imBMSCs进行成骨分化诱导，诱导后进行ALP活性定量及染色检测;诱导后进行茜素红染色检测库潘尼西抑制钙结节形成情况;qPCR和Western blot分析库潘尼西对成骨分化相关基因和蛋白表达的影响。免疫荧光法检测库潘尼西对细胞中Runx2和Col1a1的荧光表达水平的影响。双萤光素酶报告基因实验检测库潘尼西和杨梅苷对细胞中的PI3K/AKT通路下游分子Myc启动子区域的表达水平。<br>　　2 动物实验<br>　　将8周龄小鼠C57BL/6J建立OVX骨质疏松模型。除假手术组外，其余各组均进行小鼠OVX造模。假手术组和模型组分别给予相应体积的PBS溶液，其余两组腹腔注射杨梅苷溶液进行干预。8周后采集各组小鼠股骨组织和腰椎组织进行检测。股骨组织用Micro-CT扫描观察股骨远端的骨微观结构并分析相关参数，用苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)、Masson、Trap 染色评估相关变化;免疫组化和 Western blot检测小鼠体内成骨与破骨蛋白及其参与通路的表达水平。<br>　　结果:<br>　　1 细胞研究<br>　　(1)杨梅苷对小鼠imBMSCs增殖、成骨分化的作用<br>　　CCK-8测定结果显示，当在1-50μ M之间的浓度下使用杨梅苷干预细胞24 h、48 h、72 h、96 h后，加药组的imBMSCs增殖能力增强，没有观察到杨梅苷的细胞毒性作用。通过ALP染色和活性测定表明，空白对照组未见蓝色深染物形成，成骨诱导组和成骨诱导加杨梅苷组均可见ALP阳性的蓝染物，ALP活性水平升高，当浓度为25μM时，颜色最深，ALP活性水平最高。通过茜素红染色表明，空白对照组未见明显钙结节形成，成骨诱导组和杨梅苷加成骨诱导组部分细胞均可见红色钙结节形成，当杨梅苷浓度为25μM时，骨矿化最明显，红色钙结节形成的数量最多。qPCR结果显示，在25μM浓度以内的杨梅苷以剂量依赖性的方式显著上调ALP、OPN、OCN、Col1a1、Runx2和Osterix的表达。成骨分化相关蛋白的表达:Western blot结果显示，在25 μM浓度以内的杨梅苷以剂量依赖的方式显著上调OPN、OPG、Col1a1、Runx2和Osterix的表达。<br>　　(2)高通量转录组测序探究杨梅苷对成骨机制的影响:火山图显示共有77个基因上调，169个基因下调。对排名前20的上调或下调差异基因进行了聚类热图分析。结果表明，与 OIM 组相比，MYR 组的 ler2、Slc23a3、Nyx、Sox11、Kcnj4、Slc39a12 等基因的表达水平显著上调。与OIM组相比，MYR组的Cd93、Gbp5、Gm9780、Trim34a2、Spire2等基因的表达水平显著下调。GO Biological Process显示血管生成生物学过程参与了成骨分化的过程。KEGG通路分析发现，PI3K / AKT、HIF-1、Rap1信号通路等参与杨梅苷促成骨分化过程。通过Western blot验证不同浓度杨梅苷干预后，p-PI3K和p-AKT的表达增加。通过分子对接技术，杨梅苷与其对应的关键靶点小鼠磷脂酰肌醇3-激酶p110 δ(PIK3CG)(PDB ID:5ngb)出现了较高程度的连接，亲和力为-8.5 kcal / mol。PPI 蛋白互相作用的网络图表明，Ace、Edn1、Cd163、Ccn1、Adm2、Ramp1等蛋白得分较多，表明上述的蛋白可能为杨梅苷作用的靶点蛋白。<br>　　(3)库潘尼西(Copanlisib)对杨梅苷成骨分化抑制作用验证:为了进一步研究PI3K/Akt信号通路的参与杨梅苷促进成骨分化的过程，因此评估了在杨梅苷干预组中该通路对成骨的抑制作用。CCK-8结果表明，在72 h和96 h,7.8125 nM和15.625 nM copanlisib组开始抑制细胞增殖。通过ALP染色及活性测定表明25 μM杨梅苷组ALP深蓝色底物和活性表达高于25 μM杨梅苷+copanlisib 10 nM组;通过茜素红染色表明25 μM杨梅苷组红色的钙结节数量高于25 μM杨梅苷+copanlisib 10 nM组。qPCR结果显示，在25 μM浓度的杨梅苷联合库潘尼西组的ALP、OPN、OCN、Col1a1、Runx2和Osterix的mRNA表达水平显著低于25μM浓度的杨梅苷组。Western blot结果显示，在25 μM浓度的杨梅苷联合库潘尼西组的OPN、OPG、Col1a1、Runx2和Osterix的蛋白表达水平显著低于25 μM浓度的杨梅苷组。免疫荧光结果表明，在25μM浓度的杨梅苷联合库潘尼西组的Runx2和Col1a1的荧光强度显著低于25 μM浓度的杨梅苷组。双萤光素酶报告基因实验测定结果显示，在25 μM浓度的杨梅苷联合库潘尼西组的Myc的荧光强度显著低于25 μ M浓度的杨梅苷组。<br>　　2 动物实验<br>　　通过micro-CT三维重建分析结果发现，相比于假手术组，模型组中骨体积分数(BV/TV),骨小梁数量(Tb.N)，骨小梁厚度(Tb.Th)，骨密度(bone mineral density,BMD)值均降低;骨小梁分离度(Th.Sp),结构模式指数(Structure model index,SMI）的值明显升高;股骨远端出现明显骨丢失，骨小梁断裂等骨质疏松微观表现，而杨梅苷低剂量组和高剂量组可以明显减轻去卵巢小鼠中的骨丢失情况。Western blot结果显示，与假手术组相比，模型组OPN、OPG、OCN、p-PI3K以及AKT表达显著降低;而 NFATc1、Acp5、CTSK、c-fos、MAPK 信号通路 p-p38MAPK、p-JNK,p-ERK 表达量显著升高。给药后，杨梅苷低剂量与高剂量药物组与模型组相比，OPN、OPG、OCN、p-PI3K 以及 AKT 表达显著升高;NFATc1、Acp5、MAPK 信号通路 p-p38MAPK、p-JNK、p-ERK表达量显著降低。HE及Masson染色结果分析发现，杨梅苷可以部分减轻去卵巢小鼠中的骨组织紊乱以及骨丢失的状况，促进纤维组织的新生。Trap染色分析表明杨梅苷可以抑制去卵巢小鼠中的破骨细胞数量，从而减轻骨量流失。免疫组化结果显示，模型组小鼠股骨组织中成骨相关基因OPG,OPN,OCN以及p-PI3K含量显著低于假手术组，在杨梅苷低剂量和高剂量干预组中，OPG、OPN、OCN、p-PI3K含量相较于假手术组显著提升;模型组小鼠股骨组织中破骨相关基因NFAT2、c-fos、Acp5以及CTSK的含量明显高于假手术组;在杨梅苷低剂量和高剂量干预组中，NFAT2、CTSK和Acp5含量相较于假手术组显著减少。<br>　　结论:<br>　　1.中药单体活性成分杨梅苷在体外实验中可以部分依赖于PI3K/AKT信号通路显著促进小鼠imBMSCs的成骨分化，同时抑制imBMSCs的成脂肪分化。<br>　　2.杨梅苷可以抑制由MAPK信号通路介导RAW264.7细胞的破骨分化。<br>　　3.杨梅苷在体内能够减缓因雌激素分泌不足造成的骨质疏松并减轻骨小梁的丢失,同时减少破骨细胞的数量和活性，具有良好的抗骨质疏松的效应。