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摘要功能性消化不良（Functional Dyspepsia,FD）临床症状复杂多样，患病率高，当前的常规用药虽有效果，但远期疗效欠佳，需长时间规律服药，且常伴有诸多副作用,因此寻求针对FD的新疗法十分必要。传统中医药的诸多外治法，尤其是推拿疗法可以在无需用药、较少副作用的基础上有效缓解FD的多种症状，是国内中医临床常用的治疗手段，值得对其进行深入探讨。胃动力不足是FD的基础发病机制之一，而调节消化道平滑肌收缩运动的IP3-CaM-MLCK信号通路是其中的重要环节，已有研究显示多种中医传统疗法能在不同程度上经由该通路对胃动力产生调节作用。<br>　　目的:<br>　　本课题一方面立足于推拿手法“缓急补泻”的基础理论，研究不同快慢频率的一指禅推法对FD脾虚证家兔胃肠功能的影响;另一方面基于IP3-CaM-MLCK信号通路,探讨一指禅推法改善FD脾虚证家兔胃动力的作用机理。<br>　　方法:<br>　　实验一:采用低、中、高不同浓度的大黄芒硝番泻叶合剂灌饲正常家兔，并结合饥饱失常法进行连续28天的FD脾虚证家兔建模实验，记录每7天各组家兔的外观表征、体重、进食量、饮水量与肛温以及造模后的胃排空率和小肠推进率。观察不同浓度药液灌胃、不同建模周期下家兔胃肠功能的变化，探讨成功建立FD脾虚证家兔模型的适当灌胃剂量和造模时长，从而指导本课题拟定一个用药剂量和建模周期均较优化的造模方案。<br>　　实验二:邀请三位推拿医师根据家兔的行为表现，在各自8只FD脾虚证家兔中脘穴处分别行轻、中、重度压力的一指禅推法，运用MFF多点薄膜压力测试系统测定并采集每次手法的压力值，同时观察记录其对应的家兔阳性行为反应项目数。从横向和纵向的角度，观察三位医师不同等级手法压力的差异程度，以及不同等级手法压力值与家兔阳性行为反应的对应情况。将三位推拿医师手法操作的轻、中、重度三个压力值范围分别设为机械臂模拟手法的压力参数，然后用机械臂于8只FD脾虚证家兔的中脘穴处模拟手法，并观察记录家兔出现的阳性项目数，再与人为操作手法的阳性项目数对比，观察人机操作下的手法压力对FD脾虚证家兔所产生作用强度的差异性。由此寻求机械臂模拟一指禅推法的适中压力参数范围，从而为一指禅推法频率-补泻效应实验提供稳定且可量化的研究条件。<br>　　实验三:造模前随机抽取的12只家兔设为空白组（K组），造模后将50只符合建模标准的FD脾虚证家兔随机分为5组，分别是模型组（P组）、低频率手法组（A组）、高频率手法组（B组）、低频率手法+抑制剂组（Ⅰ-1组）、高频率手法+抑制剂组（Ⅰ-2组）。用机械臂在家兔中脘穴和天枢穴（双侧）操作不同快慢频率的一指禅推法，并选择性地经腹腔注射MLCK抑制剂（ML-9）。观测不同时间点各组家兔的外观表征、体重、进食量、饮水量和肛温等状况，以及干预后的胃排空率、小肠推进率情况，观察不同频率一指禅推法对FD脾虚证家兔胃肠动力宏观表现的影响。<br>　　实验四:家兔的分组和干预方式同“实验三”，然后采用ELISA法检测各组家兔的血清MTL、GAS含量以及胃窦组织IP3、cAMP和ATP含量，采用Real-Time PCR法检测胃体平滑肌组织的CaM、MLCK、MLCP基因表达水平，采用Western Blot法检测胃体平滑肌组织的CaM、MLCK、MLCP蛋白相对表达量。通过各组家兔上述指标的变化情况，观察不同频率一指禅推法对FD脾虚证家兔胃平滑肌IP3-CaM-MLCK信号通路表达的影响。<br>　　结果:<br>　　实验一:通过对比不同用药剂量和造模周期所建成的模型效果，确立较为优化的FD脾虚证动物模型建模方案。研究结果显示，中、高剂量组家兔在造模第21天和第28天都出现了外观表征上的明显变化，而低剂量组则始终没有明显的FD脾虚表现。在体重、进食量和肛温上，高剂量组于造模第14天都出现明显变化，并随造模时间延长而呈下降趋势;中剂量组家兔的体重、进食量也在造模第14天出现明显减少并呈下降趋势;中、高剂量组饮水量都在造模第21天开始明显减少。低剂量组在造模第28天才出现体重明显下降，进食量则在造模第21天较空白组显著减少，但随后反弹，其饮水量和肛温则始终未见明显变化。造模结束后，中、高剂量组家兔造模后的胃排空率均明显低于空白组，三个灌胃组家兔造模后的小肠推进率都比空白组更低。另外，高剂量组在造模最后阶段出现2例家兔死亡。因此，我们最终确定灌胃药液浓度为40％、建模周期为21天的方案，可以成功构建符合模型评价标准的FD脾虚证家兔，是建立该动物模型较为优化的造模方案。根据中剂量组家兔的宏观表现，并参考多个相关诊疗指南和含有模型评价标准的文献，我们初步细化了 FD脾虚证动物模型的评分标准，总分为13分，评分≥7分者为建模成功，并以此作为后续实验中判断FD脾虚证模型是否建模成功的评分标准。<br>　　实验二:通过比较不同操作者之间和人机之间的一指禅推法压力值及相应的家兔行为学反应，探寻并明确机械臂模拟一指禅推法的适中压力参数。结果显示，同位医师操作不同压力等级的手法压力值均出现明显不同，而三位医师于家兔操作同一压力等级手法的压力值都没有差异，说明操作不同压力等级手法产生的压力值具有界限清晰的差异，但三位医师的手法在压力值上具有一定的稳定性和趋同性。另外，每位医师不同压力等级手法对应产生的阳性项目数之间的异同与压力值基本一致，进一步佐证了人为操作不同压力等级手法压力值的差异性和操作同一压力等级手法压力值的趋同性。然后整合三位医师各压力等级的手法压力值（轻度为1.23±0.14N,中度为2.66±0.42N,重度为4.71±0.31N）,并设定在机械臂操控系统中，于家兔中脘穴处模拟一指禅推法，最后对应产生的阳性行为学项目数符合不同等级手法分级标准的比例是91.67％,且与同一压力等级人为手法产生的阳性项目数之间都没有差异。这说明同一压力等级下，人为操作与机械臂操作对FD脾虚证家兔行为反应的影响十分接近,即表明人机操作手法的压力值之间具有同质性。因此在后续实验中，我们将人为手法的中度压力值范围2.66±0.42N设为机械臂模拟一指禅推法的标准压力参数。<br>　　实验三:研究结果发现，A、B组家兔的外观表征随着干预时间的延长逐渐好转,并于干预第10天有明显改善，但B组最终效果不如A组;而Ⅰ-1、Ⅰ-2组家兔变化不大。干预后，A组家兔的体重较P组显著增加;B组、Ⅰ-1组和Ⅰ-2组则未见改变，且在干预第10天明显低于A组。在进食量上，A、B组家兔经手法干预后明显多于P组;Ⅰ-1组和Ⅰ-2组则未见明显变化。在饮水量上，A组与Ⅰ-1组在干预第10天都较P组显著增加，而B组饮水量则明显少于A组。这说明一指禅推法对家兔外观表征、体重、进食量和饮水量等宏观表现具有改善作用，且低频率一指禅推法的效果比高频率一指禅推法更佳;除了饮水量之外，ML-9或能阻滞一指禅推法对FD脾虚证家兔上述其他宏观表现的改善作用。干预后，仅A、B组家兔的胃排空率较P组升高，而在小肠推进率方面仅A组较P组明显升高，并且其余3个干预组都低于A组，这表明一指禅推法能有效提高家兔的胃肠动力，且低频率一指禅推法的促进作用明显优于高频率一指禅推法;ML-9可能对一指禅推法于FD脾虚证家兔胃肠动力的影响产生阻滞作用。<br>　　实验四:经手法干预后，ELISA检测结果显示，4个干预组的血清MTL与P组比较均明显升高，而血清GAS则明显下降;B组的血清MTL低于A组，而血清GAS明显高于A组;Ⅰ-1和Ⅰ-2组之间也出现类似于A、B组之间的差异。在胃窦组织IP3、cAMP和ATP水平上，A组和B组的这三个指标都比P组明显升高;B组和Ⅰ-1组的指标水平都明显低于A组;而Ⅰ-2组的指标水平比B组更低。这说明一指禅推法能有效调节家兔血清MTL、GAS和胃窦组织IP3、cAMP和ATP水平，且低频率一指禅推法的改善作用明显优于高频率一指禅推法。另外还表明，血清MTL、GAS这两个指标不受ML-9的影响，胃窦组织IP3、cAMP和ATP的含量水平则会受到ML-9的阻滞。RT-PCR检测和West-Blot检测结果显示，与P组比较,4个干预组CaM的mRNA表达量均明显升高，且A组和B组、Ⅰ-1组和Ⅰ-2组之间出现了基本一致的变化趋势;A组和Ⅰ-1组的CaM蛋白表达量比P组明显更高，且A组和B组、Ⅰ-1组和Ⅰ-2组之间同样存在趋势一致的明显差异。这说明低频率一指禅推法能比高频率一指禅推法更好地上调家兔胃体平滑肌的CaM表达,且该表达不受ML-9的影响。在胃体组织MLCK和MLCP的mRNA和蛋白表达上，A组和B组均明显高于P组，且A组优于B组，表明低频率的一指禅推法在上调家兔胃体组织的MLCK和MLCP表达方面比高频率的一指禅推法效果更佳。而A组明显高于Ⅰ-1组，B组也比Ⅰ-2组更高，则说明ML-9对家兔胃体平滑肌的MLCK和MLCP表达可能存在阻滞作用。<br>　　结论:<br>　　一指禅推法能有效改善FD脾虚证家兔的体重、进食量、饮水量和胃肠转输能力等胃肠动力状态，且低频率手法对FD脾虚证家兔胃肠功能的改善作用比高频率手法更佳，其机制可能与IP3-CaM-MLCK信号通路的调控相关。一指禅推法能通过增加相关脑肠肽的释放，上调IP3-CaM-MLCK信号通路相关因子的表达水平，促进胃体平滑肌的收缩运动，揭示了一指禅推法调节FD脾虚证家兔胃动力的作用机制。