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摘要目的<br>　　1.通过临床病例探讨骨质疏松与脂代谢的关系。<br>　　2.探索我院著名院内制剂补气通络胶囊潜在抗骨质疏松作用疗效。结合不同方法的网络药理学与生物信息学分析，探讨补气通络胶囊抗骨质疏松疗效潜在成分与潜在分子作用机制，同时，比较讨论不同分析方法的异同。<br>　　3.基于UPLC-QTOF/MS液相-质谱联用技术验证与揭示补气通络胶囊抗骨质疏松潜在成分。<br>　　4.在细胞与动物水平，验证补气通络胶囊对人骨髓间充质干细胞增殖、迁移的影响及抗骨质疏松部分作用机制。<br>　　内容与方法<br>　　1.临床病例研究。<br>　　采用回顾性研究分析的方法，纳入2021年3月-2023年3月因髋或膝骨关节炎在我科住院的绝经后女性患者，根据骨密度和中医辨证纳入符合气虚血瘀型骨质疏松者30例为实验组，纳入气虚血瘀型正常骨密度患者30例作为对照组，收集骨密度和脂代谢相关指标，进行相关性分析。<br>　　2.网络药理学与生物信息学研究<br>　　采用TCMSP+GeneCards数据库模式方法与HERB+GeneCards数据库模式方法分析补气通络胶囊活性成分及对骨质疏松作用靶点，比较两种方法结果的异同。<br>　　(1)TCMSP+GeneCards数据库模式方法:从TCMSP数据库获得补气通络胶囊所有成分及靶点，结合口服生物利用度、类药性对有效成分进行初步筛选得到初步潜在有效成分，并对成分进行归类分析。检索Genecards数据库获得骨质疏松作用靶点，对药物与疾病靶点取交集得到药物潜在靶点，利用cytoscape软件构建成分靶点调控网络以及利用STRING数据库构建蛋白互作网络。利用R软件对潜在作用靶点进行GO分析，利用Metascape数据库对潜在作用靶点进行KEGG生物信息学分析。<br>　　(2)HERB+GeneCards数据库模式方法:从HERB数据库获得补气通络胶囊所有成分靶点，检索GeneCards数据获得骨质疏松作用靶点，对药物与疾病靶点取交集得到药物潜在靶点，利用STRING构建蛋白互作网络。利用R软件对潜在作用靶点进行GO分析，利用Metascape数据库对潜在作用靶点进行KEGG生物信息学分析。<br>　　3.补气通络胶囊的有效成分的高效液相-质谱研究<br>　　采用WatersSynaptG2-Si四级杆飞行时间串联质谱与Unifi处理软件分析补气通络胶囊的化学成分。<br>　　4.体内外试验研究<br>　　(1)细胞试验:借助CCK-8、Transwell培养小室迁移试验观察一定浓度范围的补气通络胶囊对人骨髓间充质干细胞增殖、迁移的影响，Westernblotting及免疫荧光验证生信分析结果部分机制。采用PI3K小分子抑制剂LY294002验证补气通络胶囊调控PI3K/AKT通路促进人骨髓间充质干细胞迁移机制。<br>　　(2)动物试验:体内建立去卵巢小鼠骨质疏松模型，并使用补气通络胶囊进行干预，Micro-CT扫描分析实验组和对照组小鼠骨质疏松骨组织参数;骨组织脱钙、包埋，HE染色观察小鼠骨组织病理情况;免疫组化检测骨质疏松关键靶点蛋白。<br>　　结果<br>　　1.临床研究分析结果<br>　　骨质疏松组患者血清甘油三酯、载脂蛋白A1、高密度脂蛋白高于骨质正常组，但差异没有统计学意义;骨质疏松组患者血清总胆固醇(5.5933±0.8086**)、载脂蛋白B(1.068±0.2034**)、低密度脂蛋白(3.5943±0.7409**)水平明显高于非骨质疏松组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。<br>　　2.网络药理学与生物信息学研究结果<br>　　(1)TCMSP结合GeneCards数据库分析:从TCMSP数据库中总共获得补气通络胶囊101个潜在作用成分，其中丹参65个，黄芪20个，姜黄3个，红参4个，川芎7个，当归2个。在GeneCards数据库共得到绝经后骨质疏松症靶点1224个。将药物潜在成分靶点汇总，与疾病靶点进行一一映射得到124个候选靶点(补气通络胶囊抗骨质疏松治疗靶点)，将124靶点导入STRING数据当中生成PPI蛋白相互作用网络，设置最高置信度(0.9),并勾选隐藏在不同网络中的靶点。进一步筛选得到111个靶点，借助R软件运行靶点连接度排序脚本进行排序，得到前30个核心靶点。与此同时，对111个候选靶点进行GO与KEGG分析发现上述靶点主要富集在氧化应激及DNA转录因子结合过程，脂代谢通路、PI3K/AKT通路、凋亡通路、VEGF通路，TNF通路以及NF-KB通路。<br>　　(2)HERB结合GeneCards数据库分析:根据中药名称在HERB数据库中进行检索分别获得黄芪靶点162个，丹参靶点139个，当归靶点39个，姜黄靶点72个，红参靶点15个，川芎靶点36个，总共获得462个药物靶点，去重后得到294靶点。同样方法在GeneCards数据库进行检索共得到绝经后骨质疏松症靶点1224个。将药物靶点与疾病靶点进行一一映射得到122个靶点，导入到STRING数据库中，设置最高置信度(0.9),并勾选隐藏不在网络中的靶点进一步筛选得到104个靶点，借助R软件运行靶点连接度排序脚本进行排序，得到前30个核心靶点。与此同时，对104个候选靶点进行GO与KEGG分析发现上述靶点主要富集于化学应激、氧化应激及细胞因子结合过程，脂代谢通路、PI3K/AKT通路、凋亡通路、FOXO通路、JAK-STAT通路等。两种分析方法获得潜在治疗靶点总数相差不大，脂代谢通路、PI3K/AKT通路及AKT靶点为共同通路及共同核心靶点，GO-BP共同为氧化应激生物过程，GO-CC及GO-MF存在较大差异。<br>　　3.补气通络胶囊的有效成分的高效液相-质谱研究<br>　　借助高效液相-质谱联用检测技术，共发现了补气通络胶囊45种活性成分，对其质谱响应程度排名共筛选出20种主要活性成分，分别为邻苯二甲酸酐、甜菜碱、丹参酮二酚、黄芪异黄烷苷、黄芪皂苷、香豆素、亚麻酸、柳杉醇、别罗勒烯、芒柄花苷、罂酸、铁锈醇、环黄芪醇、人参皂苷、丹参酮ⅡA、黄芪碱F。而这些成分已经有较多关于调控脂代谢和维持骨平衡的报道。<br>　　4.体内外实验研究结果<br>　　（1）细胞试验:CCK-8实验结果发现，补气通络胶囊能够促进人骨髓间充质干细胞增殖。Transwell实验发现，与对照组相比，10μg/ml补气通络胶囊溶液显著促进人骨髓间充质干细胞迁移。其上调迁移相关标志蛋白MMP2、MMP9,机制蛋白磷酸化PI3K及磷酸化AKT。Transwell回复实验结果表明，与对照组相比，PI3K抑制剂LY294002显著抑制了人骨髓间充质干细胞迁移，而10μg/ml补气通络胶囊溶液显著逆转了这一趋势。<br>　　（2）动物试验:Micro-CT、HE染色结果显示，与对照组相比，骨质疏松模型骨组织破坏严重，骨髓腔脂肪细胞浸润。与模型组相比，补气通络胶囊显著改善去卵巢诱导的骨小梁骨丢失以及脂肪细胞浸润。免疫组化结果显示补气通络胶囊显著下调脂代谢相关蛋白（骨质疏松骨脂平衡-成脂关键转录因子PPARG）表达。<br>　　结论<br>　　1.通过临床回顾性研究分析，发现绝经后气虚血瘀型骨质疏松与脂代谢部分指标（总胆固醇、载脂蛋白B、低密度脂蛋白）增高存在显著相关性。绝经后骨质疏松患者存在血脂代谢紊乱，气虚血瘀是骨质疏松患者常见证型，补气通络治法可能作为中医治疗骨质疏松的重要路径之一。<br>　　2.网络药理学与生物信息学以及结合高效液相色谱活性成分分析，揭示了补气通络胶囊可能主要作用药物为丹参、黄芪，主要作用成分为丹参酮ⅡA、芒柄花黄素等成分，机制涉及PI3K/AKT通路。此外，生物信息学分析还揭示了其它可能作用过程如细胞增殖、细胞周期、凋亡、衰老等相关通路。<br>　　3.借助高效液相-质谱联用检测技术，筛选出了补气通络胶囊20种主要活性成分，这些成分与网络药理学分析结果存在不少重叠部分，如丹参酮、芒柄花苷等，与网络药理学分析结果互相得到印证。<br>　　4.体内外实验证实了补气通络胶囊主要可激活PI3K/AKT通路促进人骨髓间充质干细胞迁移，并改善去卵巢诱导的小鼠骨质疏松，体内机制部分为显著抑制脂代谢（骨质疏松成脂关键转录因子PPARG）相关过程。