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摘要哮喘是全球发病率增长最快的疾病之一，是一种由多种细胞(嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、肥大细胞、T细胞、气道上皮细胞等)和细胞组分(细胞因子)共同参与的一种以慢性气道炎症为特点的异质性疾病，也是我国的一个主要公共卫生挑战。2019年Lancet的一项研究显示，在我国20岁以上的成年人哮喘患者有4570万。<br>　　哮喘发病机制、病理生理及临床表现复杂多样。近期研究发现，Ⅱ型固有淋巴细胞(group 2 innate lymphoid cells,ILC2)与哮喘发病关系密切。ILC2缺乏抗原特异性受体，因此在受到过敏原刺激后，不需要与抗原发生特异性结合，可直接被气道上皮分泌的警报素IL33、IL25、TSLP激活，从而释放IL5、IL13炎性因子，通过与嗜酸性粒细胞、肥大细胞、中性粒细胞、树突细胞、B细胞、巨噬细胞和上皮细胞相互作用介导哮喘的发生。<br>　　白介素33(interleukin33,IL33)是气道上皮分泌的警报素之一，在组织稳态、预防寄生虫感染、诱导过敏性炎症等方面发挥多种作用。研究证实，IL33在支气管哮喘气道中的表达随着疾病的严重程度而升高，气道IL33水平与2型细胞因子水平相关，与哮喘患者嗜酸性粒细胞数量呈正相关。在哮喘的全基因组关联研究(Genome-wide association studies,GWAS)中，编码IL33及其受体ST2(IL1RL1)的基因是极少数可重复确定为主要易感性位点的基因，提示IL-33-ILC2轴在人类哮喘中的关键作用。<br>　　针刺作为我国中医药的一项瑰宝，对于哮喘的治疗与预防在临床上已早有应用。目前，已有研究证实针刺在降低气道高反应、气道炎症，改善患者生活质量方面的有效性。课题组先前采用ATG5-/-转基因小鼠证实针刺大椎穴、肺俞穴、足三里穴可通过自噬相关基因ATG5调控内质网应激诱导气道高反应T淋巴细胞亚群稳态，调节哮喘模型小鼠Th1/Th2,Th17/Treg比例失衡，从而减轻哮喘小鼠气道高反应及气道炎症。电针是在传统手针的基础上加入电流，在临床应用上电针比传统手针更加广泛。虽有研究证实其在治疗哮喘方面的有效性，但研究较少，具体机制仍有待研究。<br>　　因此，我们推测电针干预可能通过IL33-ILC2减轻哮喘气道炎症。为证实以上假说，本研究拟建立小鼠哮喘模型，通过给予ILC2扩增剂和IL33阻滞剂，观察电针大椎、肺俞、足三里穴对哮喘气道炎症、ILC2水平、ILC2分泌炎性因子功能的变化，为进一步揭示电针减轻哮喘气道炎症提供新的机制和理论依据。<br>　　目的：<br>　　观察电针对哮喘小鼠气道炎症的影响，并围绕IL33-ILC2轴探讨电针干预对哮喘小鼠气道炎症的作用机制。<br>　　方法：<br>　　1.采用卵清蛋白(ovalbumin,OVA)建立小鼠哮喘模型，分为5组：空白对照组、哮喘组、手针组、电针组、地塞米松组。通过检测不同时间点各组小鼠体重的变化，HE染色检测小鼠肺组织炎症，PAS染色检测小鼠气道上皮细胞杯状细胞增生情况，ELISA检测肺泡灌洗液IL5、IL13浓度、小鼠血清IgE浓度的变化，观察电针大椎、肺俞、足三里能否减轻哮喘小鼠的气道炎症。<br>　　2.应用三种不同过敏原进行造模，并进行电针干预：OVA造模、屋尘螨（house dust mite,HDM）造模、IL33造模。每种造模方法各分为3组：空白对照组、哮喘组、电针组。通过流式细胞分析小鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞的比例、小鼠肺组织ILC2水平、小鼠肺组织中ILC2分泌IL5、IL13的功能，qPCR检测小鼠肺组织IL5、IL13、GATA3mRNA表达水平，免疫荧光共定位观察小鼠肺组织ILC2变化，探讨电针对哮喘小鼠ILC2的影响。<br>　　3.在HDM诱发、电针干预哮喘小鼠的基础上应用ILC2扩增剂IL2/Jes6-1。分为5组：空白对照组（Control组）、哮喘组（HDM组）、电针组（EA+HDM组），哮喘+扩增剂组（HDM+IL2组），电针+扩增剂组（EA+HDM+IL2）。通过流式细胞分析检测小鼠肺组织ILC2水平、ILC2分泌IL5、IL13的功能、ILC2的增殖情况，流式细胞分析小鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞的比例，HE染色检测小鼠肺组织炎症情况，观察电针减轻哮喘小鼠气道炎症的作用是否被IL2/Jes6-1逆转，探讨电针减轻哮喘小鼠气道炎症是否依赖ILC2。<br>　　4.在上一步的基础上增加IL33抑制剂anti-IL33,分为6组：空白对照组（Control组）、哮喘组（HDM组）、电针组（EA组），HDM+IL33抑制剂组（anti-IL33组），电针+IL33抑制剂组（EA+anti-IL33组），电针+IL33抑制剂+ILC2扩增剂组（EA+anti-IL33+IL2组）。通过ELISA检测小鼠肺泡灌洗液中IL33浓度，流式细胞分析小鼠肺组织ILC2水平、ILC2分泌IL5、IL13的功能、流式细胞分析小鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞的比例，HE染色检测小鼠肺组织炎症情况，观察电针是否通过IL33-ILC2轴减轻哮喘小鼠气道炎症。<br>　　结果：<br>　　1.哮喘组小鼠体重明显低于空白对照组，哮喘组小鼠肺组织炎症、气道上皮细胞杯状细胞增生、肺泡灌洗液中IL5、IL13浓度、血清IgE浓度显著高于空白对照组。手针组、电针组、地塞米松组小鼠体重显著高于哮喘组，肺组织炎症、气道上皮细胞杯状细胞增生，肺泡灌洗液IL5、IL13浓度，血清IgE浓度均显著低于哮喘组。<br>　　2. OVA、HDM、IL33诱发的哮喘小鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞比例，小鼠肺组织中ILC2水平，小鼠肺组织ILC2分泌炎症因子IL5、IL13的功能，小鼠肺组织IL5、IL13、ILC2关键转录因子GATA3的mRNA水平均显著高于空白对照组，相应的电针干预后均有效降低。免疫荧光共定位直观的观察到HDM诱发的哮喘小鼠肺组织ILC2增多，电针干预后肺组织中ILC2减少。<br>　　3.HDM+IL2组小鼠肺组织中ILC2水平，小鼠肺组织ILC2分泌炎症因子IL5、IL13的功能，小鼠肺组织ILC2增殖情况，小鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞比例，小鼠肺组织炎症均显著高于HDM组。EA+HDM+IL2组小鼠肺组织中ILC2水平，小鼠肺组织ILC2分泌炎症因子IL5、IL13的功能，小鼠肺组织ILC2增殖情况，小鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞比例，小鼠肺组织炎症均显著高于EA+HDM组，HDM+IL2组与EA+HDM+IL2组之间以上指标没有差异。<br>　　4.与HDM组相比，EA组、anti-IL33组小鼠肺泡灌洗液IL33降低。与EA组相比，anti-IL33组、EA+anti-IL33组小鼠肺泡灌洗液IL33降低。anti-IL33组与EA+anti-IL33组相比，EA+anti-IL33组与EA+anti-IL33+IL2组相比，小鼠肺泡灌洗液IL33没有差异。<br>　　与HDM组相比，EA组、anti-IL33组哮喘小鼠肺组织中ILC2水平、小鼠肺组织ILC2分泌炎症因子IL5、IL13的功能、小鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞的比例降低。EA组与anti-IL33组相比、EA与EA+anti-IL33组相比、anti-IL33组与EA+anti-IL33组相比，以上指标没有差异。与EA+anti-IL33组相比，EA+anti-IL33+IL2组增加。<br>　　与HDM组相比，EA组、anti-IL33组小鼠肺组织炎症评分降低。与EA组相比，anti-IL33组、EA+anti-IL33组小鼠肺组织炎症评分降低。与anti-IL33组相比，EA+anti-IL33组小鼠肺组织炎症没有差异。与EA+anti-IL33组相比，EA+anti-IL33+IL2组小鼠肺组织炎症评分增高。<br>　　结论：<br>　　1.成功建立OVA经典小鼠哮喘模型，并证明电针大椎、肺俞、足三里可以有效减轻哮喘小鼠气道炎症。<br>　　2.应用三种不同过敏原OVA、HDM、IL33建立哮喘小鼠模型，结果共同显示电针减轻哮喘小鼠气道炎症与ILC2有关。<br>　　3.证实ILC2在电针干预哮喘小鼠气道炎症中的重要作用，说明了电针干预治疗哮喘气道炎症依赖ILC2。<br>　　4.证实电针通过IL33-ILC2轴减轻哮喘小鼠气道炎症。