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摘要第一部分RNA结合蛋白PCBP1在肺腺癌转移中的作用与机制研究<br>　　背景和目的:<br>　　肺腺癌(LUAD)是肺癌中最常见的组织学亚型，患者的5年生存率低于30％。找到肺腺癌进展转移的调控机制有利于发现肺腺癌治疗的新靶点，控制肿瘤进展。PolyC-RNA-bindingprotein1(PCBP1)是异质核糖核蛋白复合物的一种，可以通过与RNA和蛋白相互作用从不同层面调控基因表达发挥肿瘤抑制功能。然而,PCBP1在肺腺癌中的具体作用及机制仍不明确。本文旨在揭示PCBP1在肺腺癌转移中的功能机制。<br>　　方法与结果<br>　　方法:首先，通过癌症基因组图谱(TCGA)筛选，发现PCBP1是肺腺癌的重要生物标记物，并通过免疫组化和RT-PCR在临床样本中进行了验证。通过细胞划痕实验和Transwell实验，我们确认了PCBP1与肺腺癌细胞的迁移密切相关。接着，通过小鼠肺转移模型进一步验证了PCBP1与肺腺癌肿瘤转移的关系。机制上，通过对PCBP1敲除的肿瘤细胞及对照细胞进行转录组测序发现下游关键基因DKK1。使用蛋白质印迹、RT-PCR、RIP、RNAPull-Down、mRNA稳定性等实验验证PCBP1与DKK1和β-catenin的调控关系。最后，对临床样本进行免疫组化的检测，分析PCBP1、DKK1和β-catenin三者之间的相关性。<br>　　结果:通过对数据库的分析和临床样本检测发现与正常组织相比，PCBP1在肺腺癌肿瘤组织中表达下降，且与肺腺癌患者预后呈正相关。然后通过体外迁移实验发现PCBP1的表达降低能够促进肺腺癌细胞迁移，而小鼠肺转移模型进一步验证了PCBP1能够显著抑制肺腺癌的转移。接着通过探究PCBP1抑制肺腺癌转移的机制，发现PCBP1能够与DKK1的mRNA直接结合，通过提高DKK1的mRNA稳定性而上调其表达，DKK1的表达上调抑制了WNT/β-catenin通路的激活。最后，对肺腺癌临床样本进行检测进一步确认PCBP1、DKK1与β-catenin之间的调控关系，发现PCBP1与DKK1的表达呈显著正相关，与β-catenin呈显著负相关，且三者均是肺腺癌预后的预测分子。<br>　　结论<br>　　PCBP1通过上调DKK1的表达失活WNT/β-catenin通路抑制肺腺癌的转移,PCBP1是潜在的肺腺癌肿瘤治疗的新靶点。<br>　　第二部分转录因子KLF12通过调控CD8+T细胞介导肿瘤anti-PD-1治疗机制研究<br>　　背景和目的<br>　　以anti-PD-1治疗为代表的免疫检查点抑制剂(ImmuneCheckpointInhibitors,ICIs)疗法已经彻底改变了现有的肿瘤治疗格局，显著提高了患者的5年生存率。然而，仅有20-25％患者能够获得持久的免疫应答，大部分肿瘤患者会出现原发或者继发性耐药。anti-PD-1治疗耐药是一个极其复杂的、多分子间参与的过程，探寻anti-PD-1免疫治疗耐药的分子机制，降低其耐药性，提高免疫治疗效果，对提升患者生存率尤为重要。转录因子KLF12能够与靶基因启动子区结合发挥转录抑制功能。迄今为止，关于KLF12的研究主要集中在其对肿瘤转移和血管生成等调节的方面，关于KLF12对肿瘤浸润免疫细胞的调控作用尚未被报道。本论文旨在揭示KLF12对肿瘤微环境中免疫细胞浸润和功能的影响;探究KLF12影响肿瘤免疫的分子机制;明确KLF12与anti-PD-1疗效之间的关系，寻找改善anti-PD-1治疗效果的策略。<br>　　方法与结果<br>　　方法:首先构建了KLF12过表达和敲除的肿瘤细胞系，通过体外和体内实验观察KLF12对肿瘤微环境的影响。继而，通过转录组测序、RT-PCR、WesternBlot阐明了KLF12调控的关键下游分子，并通过挽救实验确定了两者之间的调控关系。然后通过ChIP-PCR和双荧光素酶报告等实验，明确KLF12的直接转录抑制作用。最后，通过荷瘤小鼠给予治疗，观察治疗疗效，确定KLF12等分子对anti-PD-1治疗的影响，并利用多色免疫荧光对免疫治疗队列进行染色验证，探讨KLF12等分子对anti-PD-1治疗响应率的预测作用。<br>　　结果:首先通过体内外实验确定KLF12能够通过促进CD8+T细胞的浸润和功能。其次通过转录组测序、RT-PCR和WesternBlot等实验发现Galectin-1(Gal-1)是KLF12的关键下游分子，并且通过挽救实验发现肿瘤中KLF12表达降低所引起的CD8+T细胞改变能够通过抑制Gal-1的表达得到逆转。然后通过ChIP-PCR和双荧光素酶报告结果明确KLF12抑制Gal-1转录，揭示了二者直接结合的具体区域。最后通过对荷瘤小鼠进行治疗干预证明了靶向KLF12/Gal-1通路能够提高anti-PD-1治疗疗效，并且通过检测免疫治疗样本发现anti-PD-1治疗响应率高的患者中，KLF12、CD8和PD-1表达较高，Gal-1的表达较低。<br>　　结论<br>　　肿瘤细胞中KLF12能够促进CD8+T细胞浸润，提高CD8+T细胞功能。KLF12直接靶向Gal-1的启动子区抑制Gal-1的转录和表达。靶向KLF12/Gal-1通路能够改善anti-PD-1治疗疗效。