泛癌生物标志物ZIC2在肾癌中的临床意义及作用机制研究-论文-万方医学网

泛癌生物标志物ZIC2在肾癌中的临床意义及作用机制研究

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摘要第一部分:ZIC2作为泛癌种预后生物标志物的生物信息学分析 　　目的 　　锌指蛋白ZIC2作为一种转录因子可以与各种DNA和蛋白质相互作用。目前的研究表明，ZIC2在多种癌症中起着癌基因作用。这部分研究将基于公开的多个独立数据集系统性地分析了ZIC2在多种癌症类型(泛癌)中的表达情况及预后作用。 　　方法 　　本研究挖掘了包括Oncomine、癌症基因组图谱(TheCancerGenomeAtlas,TCGA)、Kaplan-MeierPlotter和PrognoScan在内的多个公共数据库，以评估ZIC2在泛癌样本和正常对照样本之间的表达差异，然后通过Kaplan-Meier曲线和单因素Cox回归分析探讨ZIC2表达与患者预后的关系。 　　结果 　　基于Oncomine和TCGA数据库的公开数据显示，与邻近的正常组织相比，ZIC2在大多数癌症组织中的表达更高(P＜0.05)。基于TCGA、Kaplan-meierPlotter以及PrognoScan数据库的公开数据显示，ZIC2高表达在多种癌症中与较差的预后显著相关(P＜0.05)。 　　结论 　　ZIC2基因表达可能是泛癌预后差的潜在分子生物标志物，并可能作为癌基因在肿瘤发生和进展过程中具有潜在的调控作用。 　　第二部分:ZIC2在肾癌中的表达及临床意义 　　目的 　　ZIC2作为一种转录因子近年来被发现在肿瘤中表达异常且与肿瘤的生物学行为密切相关。在上一部分研究中ZIC2已经被证明是一种有效的泛癌预后生物标志物，尤其在肾癌中的预后意义更为显著。因此，本部分研究将重点探索ZIC2在肾癌中的表达及临床意义。 　　方法 　　采用TCGA、GEO以及ArrayExpress数据集对ZIC2在肾癌中的表达及预后意义进行系统性分析。同时收集本中心肾癌组织及对应的癌旁正常组织，进行蛋白质印记及免疫组化分析。采用Fisher精确检验、卡方检验、Wilcoxon秩和检验、独立样本t检验、配对样本t检验、Pearson相关性检验评估ZIC2与临床病理特征的关系。采用Kaplan-Meier曲线、受试者工作特征曲线(Receiveroperatingcharacteristic,ROC)评估ZIC2对预后的影响。通过单因素和多因素Cox回归分析确定独立的预后因素。 　　结果 　　相比较正常肾组织，ZIC2确实在肾癌中显著高表达;且ZIC2高表达患者有更差的预后;以ZIC2表达量作为预测指标，ROC曲线显示较强的预后预测效能;ZIC2表达量还与年龄、肿瘤分级分期等临床病理特征显著相关;单因素和多因素Cox回归分析显示ZIC2表达量是肾癌预后的独立预测因素。上述结果在其他外部独立数据集中基本得到了同样的验证。通过对本中心肾癌及对应的癌旁正常组织标本进行蛋白质印记和免疫组化的检测，实验结果同样证实了ZIC2在肾癌中的高表达，且与肿瘤的高级病理特征显著相关。 　　结论 　　本部分研究通过TCGA、GEO数据库以及其他外部独立数据库联合本中心肾癌及癌旁正常样本的蛋白质印记及免疫组化检测共同证实了ZIC2基因在肾癌中高表达且与肿瘤的临床病理特征及不良预后显著相关。ZIC2有望成为有前景的预后生物标志物和潜在的治疗靶点。 　　第三部分:ZIC2在肾癌体内体外的生物学功能验证 　　目的 　　在第一部分和第二部分研究中ZIC2已经被证明了是泛癌有效的预后生物标志物，尤其在肾癌中的临床意义表现得尤为突出。然而，ZIC2在肾癌中的生物学作用目前还未知。因此，该部分研究拟通过细胞学和动物性实验探索ZIC2在肾癌发生发展过程中的生物学作用。 　　方法 　　首先采用功能富集分析TCGA数据集中ZIC2低表达组和高表达组之间在Hallmark和KEGG通路中的差异，初步探索ZIC2的潜在的生物学功能。蛋白质印迹法检测常见的人肾癌细胞系ZIC2的表达情况。采用慢病毒载体构建ZIC2干扰和过表达稳定细胞株。利用CCK-8实验、克隆形成实验、EdU实验、流式细胞周期检测实验、划痕实验、Transwell实验、上皮间质转化标志物检测以及裸鼠皮下成瘤和肺转移模型实验探索ZIC2对肾癌的生物学作用。 　　结果 　　功能富集分析显示高表达的ZIC2在“KEGGCELLCYCLE”、“KEGGDNAREPLICATION”、“HALLMARKG2MCHECKPOINT”和“HALLMARKEPITHELIALMESENCHYMALTRANSITION”中显著富集。细胞学实验显示ZIC2显著促进肾癌细胞的增殖、克隆形成、侵袭、迁移、上皮间质转化能力，并且能够调控细胞G2/M周期。动物性实验显示ZIC2显著促进裸鼠的皮下成瘤能力及肺转移能力。 　　结论 　　本部分研究通过细胞学和动物学实验证实了ZIC2能够促进肾癌的恶性生物学行为，在肾癌的发生发展中可能作为一个重要的调控因子，再次提示ZIC2可能作为肾癌未来精准治疗的潜在研究靶点。 　　第四部分:ZIC2促进肾癌恶性表型的下游作用机制 　　目的 　　在前期研究中泛癌生物标志物ZIC2在肾癌中的预后表现尤为显著，进一步的细胞和动物学实验证实了ZIC2可以促进肾癌的恶性表型，然而其作用机制还未知。本部分研究将进一步探索ZIC2促进肾癌发生发展的具体下游作用机制。 　　方法 　　首先基于生物信息学分析探索ZIC2激活的下游信号通路，通过蛋白质印迹进行验证。然后结合转录因子相关数据库的预测信息探索ZIC2潜在调控的靶基因及具体结合位点，通过ChIP实验和双荧光素酶报告基因实验进行验证。除此之外，采用生物信息学方法分析ZIC2与肿瘤免疫浸润、肿瘤微环境、肿瘤免疫循环及肿瘤免疫检查点基因表达的相关性。基于前期膀胱癌中建立的八个免疫基因预后模型,探索ZIC2是否与这八个基因存在转录调控关系。 　　结果 　　功能富集分析显示高表达的ZIC2显著富集AKT/mTOR信号通路，蛋白质印迹实验证实了ZIC2激活AKT/mTOR信号通路。通过生物信息学分析结合GTRD数据库、CistromeDataBrowser数据库以及JASPAR数据库的预测，最终通过ChIP实验和双荧光素酶报告基因实验证实了ZIC2作为转录激活因子结合UBE2C启动子促进UBE2C转录进而激活AKT/mTOR信号通路。此外，功能富集分析显示ZIC2与免疫相关通路也存在显著相关，进一步的生物信息学分析发现ZIC2与肿瘤免疫浸润、肿瘤微环境、肿瘤免疫循环及肿瘤免疫检查点基因表达均存在相关性。结合既往在膀胱癌中建立的八个免疫相关基因相关风险预测模型，发现ZIC2与其中的三个免疫基因(AHNAK、ADRB2、KITLG)存在潜在调控关系。 　　结论 　　本部分研究通过生物信息学分析联合转录因子相关数据库的预测，最终通过细胞学实验证实了ZIC2作为转录因子转录激活UBE2C基因的表达，进而激活AKT/mTOR信号促进肾癌恶性表型。同时，ZIC2还有可能潜在调控AHNAK、ADRB2、KITLG三个免疫相关基因影响肾癌的肿瘤免疫。