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摘要第一部分:抑制CXCR2/PDE10A促进少突胶质细胞分化成熟的机制研究<br>　　多发性硬化症(Multiplesclerosis,MS)是一种中枢神经系统慢性炎症性疾病，以血管周围炎症、脱髓鞘、轴突损伤和神经元丢失为特征。MS的发病机制尚不明确，目前认为与遗传和环境因素有关。在脱髓鞘损伤的早期阶段，少突胶质前体细胞(Oligodendrocyteprecursorcells,OPCs)被募集至脱髓鞘区域诱导分化为少突胶质细胞(Myelinatingoligodendrocytes,OLs)。随着疾病的进展，成熟OLs的生成效率下降导致髓鞘再生能力降低。因此，诱导OPCs分化和成熟是促进髓鞘再生和改善中枢神经系统脱髓鞘的重要治疗策略。CXC趋化因子受体2(CXCchemokinereceptor2,CXCR2)是一种在外周中性粒细胞和中枢神经系统少突胶质细胞高表达的G蛋白偶联受体，参与调控OPCs的迁移、增殖和分化过程，但其调控机制尚未完全阐明，本实验旨在进一步研究CXCR2在OPCs分化成熟及促进髓鞘再生中的作用和机制。<br>　　本研究首先采用原代培养的少突胶质细胞和溴化乙锭(Ethidiumbromide,EB)侧脑室注射诱发脱髓鞘大鼠模型观察抑制CXCR2对少突胶质细胞标志蛋白表达水平的影响。结果表明当用SB225002抑制CXCR2表达后，OPCs未分化标志物血小板衍生生长因子受体α(Plateletderivedgrowthfactorreceptoralpha,PDGFRα)蛋白水平明显降低，成熟标志蛋白脂蛋白(Proteolipidprotein1,PLP1)、髓鞘碱性蛋白(Myelinbasicprotein,MBP)、髓鞘相关糖蛋白(Myelin-associatedglycoprotein,MAG)、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(Myelinoligodendrocyteglycoprotein,MOG)和接触蛋白相关蛋白(ContactinassociatedProtein,Caspr)的表达明显增加，提示抑制CXCR2可促进OPCs分化为OLs。劳克坚牢蓝(Luxolfastblue,LFB)染色可用于评价大鼠脑内髓鞘缺失程度，染色结果显示抑制CXCR2能明显改善EB大鼠胼胝体髓鞘断裂和缺失，提高髓鞘相关蛋白MBP、MAG、MOG、髓鞘相关少突胶质细胞碱性蛋白(Myelin-associatedoligodendrocytebasicprotein,MOBP)和Caspr的表达，促进OPCs的分化成熟，进而提高大鼠脑内髓鞘再生功能，减轻脱髓鞘大鼠运动障碍。实验室前期转录组学结果表明磷酸二酯酶(Phosphodiesterase10A,Pde10a)可能是CXCR2参与双环己酮草酰二腙(Cuprizone,CPZ)诱导脱髓鞘小鼠的重要基因，我们进一步在原代培养的OPCs和EB脱髓鞘大鼠模型中进行蛋白免疫印迹实验,结果证实拮抗CXCR2可显著抑制PDE10A蛋白的表达。为进一步阐明CXCR2与PDE10A的调控作用，采用免疫共沉淀和免疫荧光方法检测发现CXCR2可与PDE10A共定位并相互作用。此外，使用TAK-063抑制PDE10A的表达以及转染pcDNA-PDE10A质粒过表达PDE10A蛋白，发现抑制或过表达PDE10A均不影响CXCR2表达水平，但PDE10A蛋白表达随CXCR2表达水平减少而降低，表明PDE10A是CXCR2重要的下游蛋白，抑制CXCR2可通过调控PDE10A发挥促进髓鞘再生和修复的作用。<br>　　为进一步探究PDE10A对少突胶质细胞分化成熟以及对髓鞘再生的作用，使用TAK-063抑制PDE10A的表达观察对少突细胞谱系标记物的影响。结果表明抑制PDE10A可明显降低OPCs未分化标志蛋白A2B5的表达，促进成熟标志物PLP1、MBP、MOG和MOBP的表达;而转染Pde10a质粒过表达PDE10A蛋白后，OPCs的分化成熟能力减弱。此外，在EB诱导脱髓鞘大鼠模型中，抑制PDE10A可促进髓鞘分化成熟标志蛋白的表达，促进MS模型大鼠脑内的髓鞘再生。我们进一步使用qPCR检测髓鞘相关转录因子含量，ELISA和蛋白免疫印迹检测信号通路分子和蛋白磷酸化水平。结果显示抑制CXCR2/PDE10A后可激活cAMP/ERK1/2信号通路，促进髓鞘相关转录因子SRY-box转录因子10(SRY-boxtranscriptionfactor10,Sox10)、少突胶质细胞转录因子2(OligodendrocyteLineageTranscriptionFactor2,Olig2)、髓鞘调节因子(Myelinregulatoryfactor,Myrf)、锌指蛋白24(Zincfingerprotein24,Zfp24)的表达，最终促进髓鞘蛋白的生物合成和髓鞘再生功能。<br>　　综上所述，抑制CXCR2能够促进OPCs的成熟与分化，减轻髓鞘缺失和断裂，促进髓鞘再生。机制研究表明PDE10A/cAMP/ERK1/2是CXCR2调节髓鞘再生的下游关键信号通路。本研究阐明了CXCR2是治疗脱髓鞘疾病的重要分子靶点，并为以CXCR2为靶点研发治疗脱髓鞘疾病的药物提供理论依据。<br>　　第二部分:抑制DYRK1A通过调控小胶质细胞极化治疗帕金森氏病的作用与机制研究<br>　　帕金森氏病(Parkinson''sdiseases,PD)是人类第二大中枢神经系统退行性疾病,以黑质致密部多巴胺能神经元变性和路易小体形成为主要病理特征。PD的发病机制尚未完全阐明，目前认为与遗传因素、年龄、性别、环境因素和行为习惯等多种因素均有关。越来越多的证据显示，PD具有明显的神经炎症和免疫功能异常，与抑郁、睡眠障碍和胃肠功能紊乱等非运动症状有关。此外研究表明在PD患者血清和脑脊液中促炎因子含量显著升高，脑内炎性细胞浸润以及小胶质细胞活化水平明显增强。组织学和影像学检查同样证实患者脑内存在持续的神经炎症反应，介导多巴胺能神经元受损，在PD疾病进展中发挥着重要作用。因此抑制脑内过度激活的神经炎症反应，缓解或阻止多巴胺能神经元变性过程是目前PD治疗的重要策略。<br>　　酪氨酸磷酸化调节激酶1A(Dualspecificitytyrosine-phosphorylation-regulatedkinase1A,DYRK1A)是一种双底物特异性的蛋白激酶。研究发现，DYRK1A除了介导神经元发育和细胞周期调节等生物学过程，还可通过调控神经炎症反应在多种神经退行性疾病发病中起着重要作用。在PD疾病进展中，DYRK1A通过磷酸化α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)和PARKIN蛋白介导神经毒性作用，但其通过调控神经炎症参与PD发病的作用和机制尚未阐明，因此本实验将在脂多糖(Lipopolysacchride,LPS)刺激的小胶质细胞神经炎症模型和鱼藤酮诱导的小鼠PD模型中，对DYRK1A介导神经炎症及多巴胺能神经元损伤的作用和机制进行研究和探讨。<br>　　首先采用LPS诱导BV2小胶质细胞构建神经炎症细胞模型观察DYRK1A激酶的变化。结果显示DYRK1A的含量和激酶活性在神经炎症中显著上调，表明DYRK1A参与炎症过程。当用Harmine抑制DYRK1A后可显著抑制小胶质细胞激活标志物离子钙结合蛋白受体分子1(Ionizedcalciumbindingadaptormolecule1,Iba1)的表达，降低炎症蛋白环氧化酶2(Cyclooxygenase2,COX2)和白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)的表达水平，进而抑制炎症反应。为了探讨DYRK1A是否可通过调控小胶质细胞极化而抑制神经炎症，本实验进一步在LPS诱导的神经炎症模型中对小胶质细胞M1型和M2型标志蛋白进行检测，发现LPS可明显刺激BV2细胞中一氧化氮合酶(Nitricoxidesynthase,iNOS)和CD86蛋白的表达，下调精氨酸酶1(Arginase1,Arg1)和甘露糖受体1(Macrophagemannosereceptor1,CD206)水平。当用Harmine抑制DYRK1A后可促进M1型BV2细胞转化为M2型，调控小胶质细胞的极化水平，抑制神经炎症反应。随后采用BV2细胞条件培养基研究DYRK1A介导神经炎症对神经元的影响。结果表明LPS可诱导BV2细胞条件培养基中产生大量炎症因子，最终导致SH-SY5Y细胞形态异常和死亡。而抑制DYRK1A的BV2条件培养基通过降低小胶质细胞中促炎蛋白和提高抗炎蛋白表达而缓解神经元损伤，提高SH-SY5Y细胞的存活率。在鱼藤酮诱导PD小鼠模型中，行为学实验结果进一步表明抑制DYRK1A可提高小鼠运动和协调能力。蛋白免疫印迹结果显示Harmine可促进小鼠中脑内小胶质细胞从M1型向M2型的转化，减轻脑内促炎蛋白产生，增加抗炎蛋白的表达。酪氨酸羟化酶(Tyrosinehydroxylase,TH)染色结果显示，Harmine可明显改善鱼藤酮诱导小鼠黑质多巴胺能神经元的丢失和死亡，提高多巴胺能神经元存活率。为进一步证实DYRK1A在PD中的调控作用，我们将DYRK1AshRNA腺病毒载体注射至α-syn(A53T)转基因PD模型小鼠的黑质区域，通过蛋白免疫印迹和免疫组织化学染色检测小鼠脑内神经炎症蛋白和TH阳性神经元数量。结果显示，A53T转基因模型小鼠中脑内DYRK1A表达显著升高。沉默DYRK1A可抑制模型组小鼠炎症蛋白iNOS和COX2的表达，抑制小胶质细胞激活，减轻黑质TH阳性神经元损伤。进一步机制研究表明，细胞凋亡信号激酶(Apoptosissignalregulatingkinase-1,ASK1)是DYRK1A蛋白的底物，抑制DYRK1A可通过降低ASK1/JNK/P38蛋白磷酸化水平调控体内外小胶质细胞极化进而减轻神经炎症反应，保护PD模型中多巴胺能神经元。此外单独抑制ASK1也可通过减轻JNK/P38蛋白激活调控M1/M2表型，证实ASK1/JNK/P38信号通路通过影响小胶质细胞极化过程参与DYRK1A介导的神经炎症反应。<br>　　综上所述，抑制DYRK1A能够通过调控小胶质细胞从M1型向M2型转化，减轻神经炎症反应，提高黑质多巴胺能神经元数量，进而改善PD模型小鼠运动功能障碍。机制研究表明ASK1/JNK/P38是DYRK1A调节小胶质细胞极化和神经炎症反应的关键信号通路。本研究不仅阐明了DYRK1A在PD模型中调控神经炎症反应的重要作用和机制，也为以DYRK1A为靶点治疗PD疾病的相关药物研发提供理论依据。