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摘要本文主要从以下几方面进行论述：<br>　　第一部分 CELF2在正常造血及MLL-AF9诱导的急性髓系白血病中的作用及机制研究<br>　　目的:<br>　　RNA结合蛋白(RNA binding proteins,RBPs)是一类可以通过识别特殊的RNA结合域与RNA互作，进而参与转录后调控的蛋白，其广义上属于表观遗传因子。作为RNA转录和翻译的关键调控因子，RBPs参与RNA剪切、转运、序列编辑、胞内定位及翻译控制等过程。先前研究表明，RBPs在急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)中经常出现表达失调。临床数据库分析显示CELF2在各核型AML中呈现不同水平的低表达并伴随着患者的预后不良，其中MLL-AF9核型病人相比其他核型病人CELF2表达量更低。然而，当前尚未有CELF2在血液系统尤其是AML中的具体作用及相关机制的研究，因此本课题在Celf2条件性敲除小鼠基础上构建了 MLL-AF9诱导的AML模型，联合体外AML细胞系共同探究CELF2在正常造血及AML中的作用机制，探索AML的治疗新靶点。<br>　　方法:<br>　　为了确认CELF2的表达是否影响AML患者的预后情况，我们首先在TCGA数据库中检索了 CELF2在AML病人中的突变情况及和预后的关系。随后构建了造血系统特异性敲除Celf2的小鼠，通过表型实验及竞争移植实验明确Celf2缺失对小鼠正常造血的影响。为了进一步探究Celf2在AML发生和发展中的作用，我们富集了造血系统特异性敲除Celf2小鼠的Lin-细胞，感染MLL-AF9逆转录病毒后移植至致死剂量照射的受体小鼠内，构建Celf2缺失的MA9诱导的AML小鼠模型。通过研究发病小鼠生存期及表型，包括骨髓及髓外造血器官中各系细胞比例及白血病干细胞(Leukemia stem cell,LSC)的比例和功能，探究Celf2对AML发生造成的影响。此外构建Poly(I∶C)诱导的条件性敲除Celf2的AML小鼠模型，在AML发展的不同时期敲除Celf2，明确Celf2在AML发展进程中造成的影响。随后，体外构建CELF2敲降的AML细胞系，检测CELF2敲降后细胞增殖、凋亡及周期造成的影响。为了进一步明确CELF2的分子作用机制，通过RNA-seq及RIP-seq联合分析，寻找CELF2的作用靶点及作用机制。最后，通过运用mTOR通路抑制剂 Rapamycin及MA9靶向小分子药物EPZ-5676对AML小鼠进行联合用药，达到较好治疗效果。<br>　　结果:<br>　　临床数据库结果显示，AML中约有9.27％的病人出现CELF2的深度缺失，同时此类发生深度缺失的病人其生存期明显短于未发生CELF2深度缺失的病人。同时在病人和小鼠中均提示CELF2在AML细胞内呈现异常低表达。随后我们构建了Vav1-cre;Celf2fl/fl(Celf2 KO)和Celf2fl/fl(Celf2 WT)造血系统特异性敲除Celf2的小鼠模型，流式检测发现GMP/CMP及Mac-1+比例及数目有所增加，同时竞争移植实验Celf2缺失后，其在骨髓中嵌合率较对照组明显增加。以上实验结果提示Celf2缺失导致其HSC自我更新能力提升并出现偏髓系分化现象，但并未出现恶性克隆性造血。进而我们构建了 MLL-AF9诱导下的Vav1-cre;Celf2fl/fl(Celf2 KO+MA9)和Celf2fl/fl(Celf2 WT+MA9)小鼠模型，生存期结果显示Celf2敲除后AML小鼠生存期明显缩短，同时肿瘤负荷明显高于对照组。将小鼠骨髓细胞进行流式检测后，发现Celf2敲除后，AML小鼠白血病细胞比例明显升高，白血病干细胞比例随之增加，且克隆形成实验结果均显示Celf2敲除后其形成克隆能力明显增强，这提示我们Celf2敲除后可能通过增加LSC的数目及功能加速了 AML的发生。随后在Poly(I∶C)诱导下的Celf2 KO+MA9和Celf2 WT+MA9小鼠的生存期和流式结果也证明Celf2敲除后加速了 AML的发展进程。RNA-seq及RIP-seq结果联合分析结果表明，CELF2可以与FAT10 mRNA直接结合并调控下游通路。通过放线菌素D对FAT10 mRNA进行标记后发现CELF2缺失抑制FAT10 mRNA降解，导致了 FAT10蛋白水平的升高，进而激活了 FAT10下游的AKT通路，促进白血病细胞增殖。最终我们通过使用mTOR通路抑制剂Rapamycin及MA9靶向小分子药物EPZ-5676对AML小鼠进行体内联合用药挽救了Celf2缺失引起的白血病细胞过度增殖，达到较好治疗效果。<br>　　结论:<br>　　(1)Celf2缺失导致了正常造血的轻微偏髓分化;<br>　　(2)Celf2的缺失加速了 MLL-AF9诱导的体内AML进程;<br>　　(3)CELF2缺失抑制FAT10 mRNA降解并激活FAT10-mTORC1信号通路;<br>　　(4)mTORC1抑制剂和DOTL1抑制剂的联合使用可以减少体内Celf2 KO+MLL-AF9白血病负荷。<br>　　第二部分 PHF6在 MLL-AF9诱导的急性髓系白血病中的作用及机制研究<br>　　目的:<br>　　PHF6基因定位于人类染色体Xq26.3,编码具有两个PHD锌指结构域的蛋白质，定位于细胞核中，具有转录调控作用，是一种X连锁的肿瘤抑制基因。PHF6基因突变可导致BFLS综合征(一种综合性X连锁智力障碍)，也可见于急性 T 淋巴细胞白血病(T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia,T-ALL)、AML 等急性白血病，其中T-ALL占比高达30％,但其在AML中占比仅约为3％。实验室前期研究表明，PHF6缺失可以促进T-ALL进程，但其缺失在Runx1-ETO9a诱导的AML中可以抑制AML进展。为了进一步确定PHF6在AML中发挥的具体作用，研究其在Runx1-ETO9a诱导的AML中发挥的功能是否具有普适性，本课题利用MLL-AF9诱导的AML小鼠模型联合体外细胞系共同探究PHF6在AML发展过程中的作用，进而探究其作为AML治疗靶点的可能性。随后分析血液系统疾病中常见突变类型之一 PHF6R274X在造血系统中的作用，进一步为PHF6突变病人的精准治疗提供理论依据。<br>　　方法:<br>　　为了确认PHF6在AML患者中的表达情况，我们利用AML病人及正常人骨髓单个核细胞进行PHF6表达量的检测。随后我们富集了造血系统特异性敲除Phf6小鼠的Lin-细胞，感染MLL-AF9逆转录病毒后移植至致死剂量照射的受体小鼠内，构建Phf6缺失的MA9诱导的AML小鼠模型。通过研究发病小鼠生存期及表型，包括骨髓及髓外造血器官中各系细胞比例及白血病干细胞(Leukemia stem cell,LSC)的比例和功能，探究Phf6对AML发生造成的影响。随后，体外构建Phf6敲降的具有MLL-AF9融合的AML细胞系，检测Phf6敲降后对细胞系生长、凋亡及周期造成的影响。基于综合判定PHF6在MLL-AF9诱导的AML中的作用，从而进一步完善PHF6在不同核型AML中的作用。通过表型实验及竞争性骨髓移植实验明确PHF6R274X在正常造血中的作用。<br>　　结果:<br>　　通过分析不同核型AML细胞系及AML患者样本PHF6表达量，我们发现不同核型PHF6表达量无明显规律，且其在病人中的表达量也是不定的。而在数据库分析中我们发现，PHF6高表达的AML病人较低表达的病人生存期缩短。随后我们构建了MLL-AF9诱导下的VC;Phf6;MA9和 WT Phf6;MA9小鼠模型，生存期结果显示Phf6敲除后AML小鼠生存期明显延长，其肿瘤负荷明显低于对照组。为了进一步确认AML进展延缓的具体原因，通过将小鼠骨髓细胞进行流式检测后，我们发现Phf6敲除后不同AML代数MA9小鼠白血病细胞比例与白血病干细胞比例均明显增加，且集落形成实验表示敲除Phf6后白血病细胞中可形成稳定克隆的功能性白血病干细胞比例明显减少，且这种趋势在连续克隆传代后依然稳定维持，这提示我们Phf6敲除后可能通过减少LSC的数目及功能延缓了 AML进程。为了进一步明晰PHF6在人AML中的作用，我们构建了具有MLL-AF9融合的PHF6敲降细胞系，通过克隆形成实验，细胞增殖实验，细胞凋亡及周期实验，发现PHF6敲除后，细胞克隆形成能力明显减弱，增殖放缓，同时细胞凋亡明显增加。实验结果同MA9小鼠体内结果相吻合。同时我们发现PHF6R274X导致造血干细胞及T细胞数目增多，同时造血干细胞重建能力显著增高。<br>　　结论:<br>　　(1)PHF6的高表达与AML患者的不良预后相关;<br>　　(2)Phf6的缺失延缓了MLL-AF9诱导的体内AML进程;<br>　　(3)PHF6敲降抑制了体外AML细胞增殖，促进AML细胞凋亡。