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摘要输血相关急性肺损伤( TRALI)是一种严重的可危及生命的输血反应。与新鲜血小板(PLT)相比，输注陈旧血小板可诱导TRALI的发生，但具体机制尚未完全阐明。神经酰胺( Cer)和鞘氨醇-1-磷酸(S1P)均是具有生物活性的鞘脂。Cer可通过诱导内皮细胞凋亡、下调密闭蛋白1 (ZO-1)的表达等方式，破坏内皮屏障;S1P可通过上调血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)、ZO-1的表达，增强内皮屏障功能。Cer和S1P的相对浓度(称为“鞘脂变阻器”)的动态平衡对维持正常的内皮屏障功能至关重要。人类血小板的脂质组学研究显示，与新鲜血小板相比，陈旧血小板中的Cer浓度显著升高，S1P浓度显著降低。陈旧血小板中“鞘脂变阻器”的失衡可能通过破坏内皮屏障，进而诱发TRALI。芬戈莫德( FTY720)是S1P的结构类似物，在各种类型的急性肺损伤中，可通过增强肺内皮功能起到保护肺功能的作用，且这种作用呈剂量依赖性。FTY720是否可通过纠正“鞘脂变阻器”的失衡，发挥内皮屏障保护作用，进而预防TRALI尚不清楚。<br>　　目的:<br>　　1.分析小鼠浓缩血小板中Cer与S1P浓度的变化情况，通过“二次打击”模型构建陈旧血小板介导的TRALI小鼠模型;<br>　　2.探究不同剂量的FTY720对TRALI的干预效果以及对内皮连接蛋白VE-cadherin、ZO-1表达的影响。<br>　　方法:<br>　　1.分离制备小鼠浓缩血小板，并于保存的d0 (即制备当天)、d1、d3、d5取样,检测血液学指标、CD62P活化率以及Cer和S1P的浓度;取d1PLT进行细菌培养。<br>　　2.构建陈旧血小板介导的TRALI小鼠模型:将35只小鼠随机分成正常组、脂多糖(LPS) 对照组、d1PLT组、d3PLT组和d5PLT组。后3组试验当天以2mg/kg的剂量腹腔注射LPS,2h后10mL/kg经尾静脉分别注射保存了 1d、3d、5d的血小板。正常组和LPS对照组分别在对应的时间点注射相应体积的生理盐水和/或LPS。LPS注射6 h后处死小鼠并取样。检测肺组织匀浆中的蛋白浓度、肺组织湿干重比( W/D比值)以及髓过氧化物酶(MPO)活性。制作肺组织病理切片，并使用肺组织病理损伤评分标准进行评分。<br>　　3.TRALI模型构建成功后，将42只小鼠随机分成1mg/kgFTY720组、0.5mg/kg FTY720 组、0.2mg/kg FTY720 组、0.1mg/kg FTY720 组、d5PLT 组、LPS 对照组、正常组。FTY720给药方式为LPS注射1 h后分别以1、0.5、0.2、0.1mg/kg的剂量腹腔注射FTY720,LPS注射2 h后尾静脉输注d5PLT。取样和检测同上。<br>　　4.Western blot (WB)检测小鼠肺组织中VE-cadherin、ZO-1的表达水平。<br>　　结果:<br>　　1.陈旧血小板介导的TRALI小鼠模型的建立<br>　　1.1小鼠浓缩血小板的保存效果评估<br>　　随着保存时间的延长，PLT 计数(d0 vs d5:965.75±54.36 vs 579.12±51.38×109/L,P＜0.0001)逐渐降低，平均血小板体积(d0vsd5:5.82±0.89 vs 10.32±0.41 fL,P＜0.0001)、血小板分布宽度(d0vsd5:5.21 ±0.14 vs 14.46± 1.24 fL,P＜0.0001)、CD62P 活化率(d0vsd5:30.01 ±2.13 vs 54.98±2.06 ％,P＜0.0001)逐渐升高。细菌培养试验为阴性。<br>　　1.2小鼠浓缩血小板中Cer与S1P浓度的变化<br>　　随着保存时间的延长，小鼠浓缩血小板中的Cer浓度(d0vsd5:43.68±3.00 vs 58.37±5.69 umol/L,P＜0.0001) 逐渐升高，S1P浓度(d0 vs d5:201.85±9.92 vs 149.81 ±4.86 nmol/L,P＜0.0001) 逐渐降低，Cer 与 S1P 的比例逐渐失衡。<br>　　1.3 TRALI小鼠模型的建立<br>　　与正常组相比，LPS对照组、d1PLT组、d3PLT组、d5PLT组小鼠肺组织匀浆中的蛋白浓度(d3PLT 组 vsd5PLT 组:5 211.27±461.60 vs 6 546.38±409.50 ug/mL,P＜0.0001)、W/D 比值(d3PLT组 vsd5PLT组:4.50±0.18 vs 4.79±0.21,P＜0.05)、MPO 活性( d3PLT 组 vs d5PLT 组:28.01±7.81 vs 49.38±4.43 U/L,P＜0.001) 以及肺损伤评分(d3PLT 组 vsd5PLT 组:6.00 ± 0.18 vs 7.24±0.38,P＜0.01)逐渐升高。肺组织病理切片显示d5PLT组小鼠的肺泡壁明显增厚，肺间质有大量的炎性细胞浸润，肺泡充血严重。这些结果表明，与输注d1PLT、d3PLT相比，LPS一次打击后输注d5PLT可以建立TRALI小鼠模型。<br>　　2.不同剂量的FTY720对TRALI的干预效果<br>　　1mg/kg FTY720不能预防“二次打击”小鼠发生TRALI:与正常组相比，1mg/kg FTY720组小鼠肺组织匀浆中的蛋白浓度(4 700.24±335.28 vs 6 170.26 ±545.50ug/mL,P＜0.0001)、W/D 比值(4.41 ±0.30vs4.88±0.25,P＜0.01)、MPO活性(19.88±7.54 vs 45.97±4.79 U/L,P＜0.0001) 以及肺损伤评分( 4.08±0.71 vs 7.92±0.65,P＜0.0001) 明显升高，与d5PLT组的差异无统计学意义(P＞0.05)。肺组织病理切片也显示1mg/kg FTY720组肺泡充血严重，肺泡壁明显增厚。<br>　　低剂量(0.5、0.2、0.1mg/kg) FTY720可以预防TRALI的发生:低剂量FTY720各组的评估指标均明显低于d5PLT组（P＜0.05）,与正常组的差异无统计学意义（P＞0.05）,且肺间质浸润的炎性细胞细胞减少，肺泡充血减少。<br>　　3.不同剂量的FTY720对VE-cadherin、ZO-1表达水平的影响<br>　　与正常组相比，d5PLT组VE-cadherin、ZO-1的表达水平显著降低（P＜0.05）。FTY720预防性给药后，1mg/kg FTY720组的VE-cadherin表达水平仍显著低于正常组（P＜0.05）,ZO-1表达水平有所升高，与正常组和d5PLT组的差异无统计学意义（P＞0.05）。与d5PLT组相比，低剂量FTY720各组VE-cadherin、ZO-1的表达水平均显著升高（P＜0.05）,趋于正常。<br>　　结论:<br>　　1.在LPS一次打击的基础上，输注“鞘脂变阻器”失衡的小鼠陈旧血小板（d5）,可以建立TRALI小鼠模型。<br>　　2. FTY720对TRALI的作用呈剂量依赖性。低剂量的FTY720 （0.5、0.2、0.1mg/kg）可通过增强小鼠的内皮屏障功能，降低通透性，减少炎性细胞浸润，预防TRALI的发生;高剂量的FTY720 （1mg/kg）则不能预防“二次打击”小鼠发生TRALI。<br>　　3.低剂量FTY720可能通过促进黏附连接蛋白VE-cadherin和紧密连接蛋白ZO-1的上调表达，增强内皮屏障功能，进而预防TRALI的发生。