检索历史 清除

摘要研究目的:<br>　　男性不育症是世界范围内的热点问题，但治疗方法较少，尤其是辐照引起的睾丸损伤治疗困难。本研究旨在探讨和评价治疗辐照所致睾丸损伤的新型药物及其潜在机制。<br>　　研究方法:<br>　　1.将成年雄性小鼠随机分组(每组6只)，使用连续5次每日全身0.5GyX线辐照(后简称IR5)构建辐照致睾丸损伤的小鼠模型，随后利用代谢组学筛选潜在治疗药物;<br>　　2.将成年雄性小鼠(每组6只)经IR5辐照后，再连续7天每日腹腔注射dibucaine(0.8mg/kg),通过睾丸HE染色和形态学测量评估其改善睾丸损伤的疗效;通过精子质量检测和各生精细胞分子标记的荧光定量PCR实验评估其改善生精功能的疗效;<br>　　3.通过药物亲和靶点稳定性试验(Darts)和计算机辅助分子对接寻找dibucaine结合的靶蛋白，对质谱结果差异蛋白(dibucaine/载体溶液)进行通路富集分析寻找下游靶向通路并利用western blot实验完成验证;<br>　　4.通过流式细胞术确定靶细胞并分离原代细胞进行后续实验;<br>　　5.在原代细胞上通过流式细胞术、Western Blot、Seahorse棕榈酸氧化压力试验、乙酰辅酶A检测和ATP检测完成机制的验证;<br>　　6.最后回到动物层面，在IR5小鼠上，将dibucaine与目标通路的抑制剂(etomoxir)和激活剂(baicalin)联用完成rescue实验。<br>　　研究结果:<br>　　1.睾丸HE染色结果和精子质量结果显示:IR5辐照造成小鼠睾丸严重损伤，第10天即出现曲细精管损伤和精子活力下降，第21天则发现生精细胞严重减少和精子活力进行性下降，第50天仍有曲细精管细胞脱落且精子活力继续下降(P＜0.05);<br>　　2.代谢组学结果显示:dibucaine在辐照组的丰度远低于Control组(P＜0.05);<br>　　3.睾丸HE染色结果显示:dibucaine可增加辐照小鼠的生精细胞，尤其是减数分裂晚期的细胞，并且dibucaine给药组的睾丸指数、形态学测量参数(生精上皮面积比、生精上皮高度、曲细精管直径、生精细胞层数、Johnsens睾丸活检评分)、精子浓度和精子总活力、各生精细胞分子标记的mRNA水平均高于辐照组(P＜0.05);<br>　　4.Darts和分子对接结果证明dibucaine可靶向结合脂肪酸氧化的关键蛋白CPT1 A,动物实验的western blot结果显示dibucaine可下调辐照引起的脂肪酸氧化蛋白上调，糖酵解和氧化磷酸化相关蛋白在各组间无明显差异;<br>　　5.脂肪酸氧化酶的流式结果证明:睾丸生精细胞和TM3细胞系的脂肪酸氧化不明显，原代Leydig细胞的脂肪酸氧化明显;<br>　　6.流式和Western Blot结果证明dibucaine能下调辐照后原代Leydig细胞的脂肪酸氧化相关蛋白;<br>　　7.Seahorse棕榈酸氧化压力试验证明dibucaine能抑制辐照后原代Leydig细胞的脂肪酸氧化过程，乙酰辅酶A检测和ATP检测结果证明辐照引起的脂肪酸氧化增高是异常且低效的增高;<br>　　8.睾丸HE及形态学测量指标显示:单用etomoxir或者baicalin对正常小鼠睾丸无明显影响;而dibucaine与etomoxir联用能更好地改善辐照小鼠的睾丸损伤，反之dibucaine与baicalin联用则抵消了部分dibucaine对辐照致睾丸损伤的改善作用。<br>　　研究结论:<br>　　总之，目前的数据表明，dibucaine通过抑制睾丸Leydig细胞的脂肪酸氧化以改善辐照致小鼠睾丸损伤。这将为治疗辐照致睾丸损伤提供新的思路和治疗手段。