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摘要研究目的:缺血性卒中(Ischemic stroke,IS)是常见的卒中类型之一，具有高致死率、高致残率、复发风险高的特点。有研究证实高同型半胱氨酸血症(Hyperhomocysteinemia,HHcy)是IS的主要危险因素之一，显著增加卒中发病风险且增加卒中患者不良预后风险，但目前作用机制尚未完全阐明。本实验通过动物和细胞模型研究HHcy是否会加重脑缺血后脑损伤以及神经功能缺损，探讨HHcy加重脑缺血后脑损伤的作用机制，以期为研究IS的发病机制和治疗提供新思路。<br>　　研究方法:动物实验以C57BL/6小鼠为研究对象，用2％ ( w/v)甲硫氨酸( Methionine,Met) 喂水3周建立HHcy模型。(1) 将小鼠随机分组:对照组( Vehicle,Veh)、HHcy 组、S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)给药组(SAM+HHcy)。SAM 为胱硫醚-β-合成酶(Cystathionine-β-synthase,Cbs)的激动剂，以 100mg/kg/d 腹腔注射1周。(2) 上述分组分别予以假手术处理( Sham) 及大脑中动脉闭塞( Middle cerebral artery occlusion,MCAO ) 处理。(3) ELISA 检测小鼠血清同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy) 含量，TTC (2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride) 染色、核磁共振成像(MRI)评估脑梗死体积，Longa score、握力测试( Grip strength)、旷场实验( Open field)、圆筒试验( Cylinder Test) 评估神经功能障碍，伊文思蓝( Evans blue,EB) 染色评估血脑屏障( Blood-brain barrier,BBB) 损伤，干湿重法测量脑水肿，免疫印迹法检测各组Occludin蛋白和Cbs蛋白的表达。<br>　　细胞实验以小鼠脑微血管内皮细胞( bEnd.3)为研究对象，采用氧糖剥夺( Oxygen-Glucose Deprivation,OGD)方法模拟细胞在体缺血缺氧的环境。(1) MTT法检测不同浓度Hcy对细胞活力的影响。(2) 免疫印迹法检测不同浓度Hcy处理和不同时间OGD处理后Occludin蛋白及Cbs蛋白的表达变化。(3)将细胞分为con组、Hcy组、OGD组、Hcy+OGD组、SAM+Hcy+OGD组，免疫印迹法和荧光定量PCR检测各组Occludin和Cbs蛋白和mRNA水平。(4) 用慢病毒感染细胞过表达cbs检验过表达效率以及检测Occludin蛋白变化。<br>　　研究结果:动物实验结果:（1） 与Veh组相比，HHcy组小鼠血清中Hcy含量明显升高（Veh 组为 7.555±3.955 ng/mL，HHcy 组为 11.85±8.04 ng/mL，P＜0.001),提示成功建立HHcy模型。（2）TTC染色与MRI示与Veh组相比，HHcy组小鼠MCAO后脑梗死体积明显增加（P＜0.05）。（3） Longa score、Grip strength行为学结果提示HHcy组较Veh组明显加重MCAO后神经功能障碍（P＜0.05）。（4）与Veh组相比,HHcy组MCAO后BBB损伤和脑水肿程度明显加重（P＜0.05）。（5） SAM+HHcy组与HHcy组小鼠血清中Hcy含量无明显差异（P＞0.05）。（6）与Sham处理相比，小鼠MCAO后脑组织中Cbs蛋白的表达明显下降（P＜0.05）。（7） MCAO处理后，与Veh组相比，HHcy组Occludin蛋白显著降低（P＜0.05）,而Cbs激动剂SAM+HHcy组较HHcy组MCAO后脑组织中Occludin蛋白明显升高（P＜0.001）。<br>　　细胞实验结果:（1） 在0-400 μmol/L范围内，Hcy对bEnd.3细胞无明显的毒性作用且不影响细胞Occludin蛋白的表达。（2） 与对照组相比，Occludin蛋白表达在OGD 30 min、60 min和120 min时都明显降低（P＜0.05）。（3）与OGD组相比，Hcy+OGD组Occludin蛋白显著下降（P＜0.01 ）。（4）与对照组相比，在给药200 μmol/L和400 μmol/L Hcy时Cbs蛋白水平显著降低（P＜0.05）。OGD 60 min和120 min时Cbs蛋白较对照组明显减少（P＜0.05）。（5） Cbs激动剂SAM+Hcy+OGD组较Hcy+OGD组Occludin蛋白明显升高（P＜0.001）。（6） Hcy+OGD组过表达cbs后Occludin蛋白较前明显升高（P＜0.001)。<br>　　结论:1、HHcy增加脑缺血后梗死体积，加重BBB损伤和脑水肿，导致神经功能障碍恶化。2、Cbs可能具有改善HHcy加剧的脑缺血后BBB损伤的作用。