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杨树琥珀酸脱氢酶(SDH)基因克隆及功能分析

摘要杨树是重要的可再生来源,也是林木研究的一种主要模式植物。琥珀酸脱氢酶(Succinatedehydrogenase,SDH)是线粒体内膜的结合酶,最近的研究表明,SDH是复合物Ⅰ和复合物Ⅲ产生超氧化物的间接调制器,复合物Ⅰ和复合物Ⅲ是线粒体中活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)的产生位点,因此SDH在线粒体ROS生成中起到重要作用,是植物活性氧的来源,参与调节植物的发育和应激反应。本研究以杨树SDH基因为研究对象,对他们的一级结构、二级结构、结构域、基因表达等进行分析,通过Gateway技术构建了35S∷PagSDH4过表达载体,通过农杆菌介导的叶盘法构建了PagSDH4过表达转基因杨树(PagSDH4-OE),通过表型分析和解剖学分析,初步揭示了其在杨树生长发育中的作用,从而为木材形成过程中相关调控网络提供重要参考,主要的研究结果如下:<br>  (1)通过BLAST在popgenie数据库中获取毛果杨(Populustrichocarpa)和拟南芥(Arabidopsisthaliana)SDH基因家族同源序列。构建进化树分析发现杨树中包含12个SDH基因,将毛果杨中的SDH分别命名为PtrSDH1~PtrSDH7、银腺杨(Populusalba×P.glandulosa,84K杨)中的SDH分别命名为PagSDH1~PagSDH7,对毛果杨SDH家族进行生物信息学分析。亚细胞定位分析结果显示,PtrSDH1~PtrSDH4、PtrSDH6基因位于线粒体,PtrSDH5基因位于叶绿体,PtrSDH7基因位于细胞核。理化特性分析结果显示,除PtrSDH3为疏水蛋白以外,其他PtrSDH均为亲水蛋白。结构域分析结果显示,PtrSDH1、PtrSDH4主要含有FAD_binding结构域,其他PtrSDH则含有FAD_binding、MAM33、HSP70等不同结构域。PtrSDH1、PtrSDH4基因在进化上具有一定的保守性,体现在稳定的蛋白质性质和结构、基因结构的保守、进化距离的保守和功能结构域的保守等方面。<br>  (2)通过杨树AspWood网站对PtrSDH基因的组织特异表达进行分析,结果显示PtrSDH1-2、PtrSDH4基因在形成层和木质部高表达,由此选择实验材料银腺杨(Populusalba×P.glandulosa,84K)中相应同源基因PagSDH1-2a和PagSDH4基因进行荧光定量PCR实验,分析他们在杨树不同组织中的表达,结果显示PagSDH1-2a和PagSDH4在幼嫩的茎中表达量最高,并且随着茎组织成熟,表达量逐渐降低。PagSDH1-2a和PagSDH4均在幼嫩叶片中高表达,在成熟叶片中表达量降低。同时PagSDH1-2a和PagSDH4均在形成层和木质部高表达,而且PagSDH4在木质部和形成层的表达量高于PagSDH1-2a,因此挑选PagSDH4基因进行下一步研究。<br>  (3)从84K杨中克隆PagSDH4基因,构建PagSDH4过表达载体,通过农杆菌介导的叶盘转化法获得PagSDH4-OE转基因杨树。选取表达量最高的PagSDH4-OE-1和PagSDH4-OE-4进行表型观察,发现PagSDH4-OE杨树表现出高大、粗壮、叶片较大,株高与地径比未转基因的对照组84K显著增加。组织切片结果显示PagSDH4-OE在木质部宽度、导管数目上均大于对照组84K,表明PagSDH4过表达促进了植株木质部的分化和发育。以上结果表明过表达PagSDH4基因能够促进杨树维管组织中木质部细胞的分化,使植株木质部导管细胞数量显著增加。<br>  综上所述,本研究鉴定了毛果杨PtrSDH基因的结构及功能,解析了银腺杨中PagSDH4基因在杨树生长发育中的作用,发现了过表达PagSDH4基因能促进杨树木质部的分化和发育,为木材形成的相关调控网络构建提供了重要线索,同时为林木遗传育种提供了理论参考。

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