检索历史 清除

摘要背景<br>　　真核生物的RNA聚合酶Ⅲ(PolⅢ)负责合成细胞中的tRNA、5SrRNA、7SLRNA、U6SnRNA以及其它非编码RNA。PolⅢ产物在核糖体组装、蛋白质合成与运输、基因转录调节、代谢和细胞生长等过程中发挥着重要作用。PolⅢ指导的基因转录的失调与肿瘤的发生和细胞增殖密切相关。核糖体蛋白S6激酶A2(RPS6KA2,别名RSK3)是丝氨酸/苏氨酸激酶RSK(核糖体S6激酶)家族的成员。该激酶包含两个不相同的激酶催化结构域，并通过磷酸化不同底物参与调节细胞生长和分化等多种生理生化活动。本实验室以前的研究结果表明，RPS6KA2促进PolⅢ所指导的基因转录，但其中的调节机制还不清楚。本课题利用各种分子和生物学手段研究并揭示RPS6KA2介导的PolⅢ基因转录调节机制。<br>　　方法<br>　　利用已构建的RPS6KA2shRNA、RPS6KA2-mCherry慢病毒表达载体和包装质粒pH1和pH2转染293T细胞并包装病毒;随后利用获得的慢病毒转导HeLa和HepG2细胞建立RPS6KA2敲低和过表达稳定细胞系。利用Westernblot和RT-qPCR分别检测稳定细胞系中RPS6KA2和PolⅢ产物的表达。细胞计数、EdU、克隆形成实验和裸鼠成瘤实验分析RPS6KA2表达改变对细胞增殖活性的影响。染色质免疫沉淀(ChIP),Westernblot和RPS6KA2与p21双敲低实验探究RPS6KA2介导的PolⅢ基因转录调节机制。<br>　　结果<br>　　RPS6KA2敲低抑制PolⅢ指导的基因转录，RPS6KA2过表达则促进PolⅢ产物的表达;说明RPS6KA充当PolⅢ转录的激活子。增殖实验和成瘤实验结果表明，RPS6KA2在体内、体外促进肿瘤细胞增殖。利用RPS6KA2过表达的细胞系施加PolⅢ抑制剂，结果显示，RPS6KA2介导的细胞增殖激活受PolⅢ转录水平的影响。ChIP-qPCR结果表明，RPS6KA2敲低降低PolⅢ转录机械因子在PolⅢ靶基因位点上的结合。Westernblot结果显示，RPS6KA2能够抑制周期蛋白激酶抑制子p21的表达，而对大多数PolⅢ转录调节相关的其它蛋白的表达无显著影响，或者差异调节某些所检测的蛋白。通过建立RPS6KA2和p21双敲细胞系和p21沉默细胞系敲低，RT-qPCR分析PolⅢ产物显示，p21不仅参与调节RPS6KA2介导的PolⅢ转录，也能独立调节PolⅢ的转录。转染靶向p21mRNA的miRNA模拟物可降低p21的表达和增加PolⅢ产物的表达。RNA免疫沉淀和RT-qPCR提示，RPS6KA2能够与细胞质中的miR-95-3p互作。<br>　　结论<br>　　RPS6KA2能够与细胞质中的miR-95-3p结合并影响miR-95-3p的表达或稳定性;miR-95-3p表达升高抑制p21的表达。p21表达抑制导致TBP、GTF3C2的表达增加从而促进PolⅢ指导的基因转录。因此，RPS6KA2通过调节miR-95-3p-p21-TBP/GTF3C2通路激活PolⅢ指导的转录。这些发现为了解PolⅢ指导的基因转录机制提供了新视角。