检索历史 清除

摘要非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指除酒精和其他明确的损肝因素所致的，病变主要在肝小叶，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变性和脂肪贮积为病理特征的临床病理综合征，其发病机制复杂，目前尚未有批准用于治疗该疾病的药物。肝脏脂质过度蓄积是NAFLD发生发展的重要因素之一，AMP激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK )及其下游靶蛋白固醇调节元件结合蛋白-1c ( Sterol regulatory element-binding protein-1c，SREBP- 1c)和乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl coenzyme A carboxylase,ACC)在脂质合成中发挥重要作用，调节AMPK/SREBP-1c/ACC信号通路减少脂质合成可能会降低脂质过度蓄积诱发脂毒性对组织细胞的伤害。Compound C作为AMPK特异性抑制剂在实验研究中常作为机制研究首选。<br>　　地奥心血康(Di''ao Xinxuekang，DXXK)是从薯蓣科植物黄山药或穿龙薯蓣根茎中提取的甾体总皂苷，是第一个进入欧盟市场的中成药，能显著改善高脂饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪性肝炎和大鼠肝脏脂肪变性。DXXK是否通过激活AMPK及其下游靶蛋白发挥治疗NAFLD的作用目前仍然未知，因此本文提出DXXK可能通过调节AMPK/SREBP-1c/ACC信号通路减少脂质合成发挥改善非酒精性单纯性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver，NAFL)的作用。<br>　　目的:<br>　　(1)构建体内外NAFL疾病特征模型，明确地奥心血康对NAFL的改善作用;<br>　　(2)探讨地奥心血康是否可以通过调节AMPK/SREBP-1c/ACC通路减少脂质合成进而改善NAFL。<br>　　方法:<br>　　(1) DXXK对高脂高胆固醇饮食诱导的大鼠NAFL的治疗作用及对AMPK/SREBP-1c/ACC信号通路的影响:67只健康雄性SD大鼠，随机分为正常组和造模组，造模组采用高脂高胆固醇饲料饲喂8周，8周末造模组随机处死5只大鼠，正常组随机处死2只大鼠，进行肝脏组织病理学检查，发现造模组5只大鼠肝脏均有5个以上视野发生肝脏脂肪变且面积＞1/3,确认模型建立成功，将造模组大鼠随机分为模型组、阿托伐他汀组(2.0mg·kg-1)，DXXK高、中、低(100、30、10 mg·kg-1)剂量组，n=10,灌胃给药连续8周。全自动生化分析仪检测血脂(胆固醇(Total cholesterol，TC)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、低密度脂蛋白胆固醇(Low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C )及肝功能(谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸转氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)、碱性磷酸酯酶(Alkaline phosphatase,ALP)、乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)及γ-谷氨酰转移酶(γ-Glutamyl transpeptidase，GGT)水平;试剂盒检测肝脏脂质TC、TG、游离脂肪酸(Free fatty acid,FFA)水平;计算肝脏指数;对肝脏组织病理进行非酒精性脂肪性肝病活动度评分(Non-alcoholic fatty liver disease activity score,NAS);油红O染色观察肝脏脂肪变面积;透射电镜观察肝细胞细胞核及内容物的超微结构变化;Western blot法测定肝脏AMPK、p-AMPK、SREBP-1c、ACC、p-ACC 蛋白表达。<br>　　(2) DXXK对油酸-棕榈酸诱导的人肝癌细胞(Human hepatocellular carcinoma cells,HepG2)脂质蓄积模型的改善作用及对AMPK/SREBP-1 c/ACC信号通路的影响:药效研究部分取对数生长期HepG2细胞接种于6孔板中，将HepG2细胞分为对照组、模型组、阿托伐他汀组(1μM)、地奥心血康高中低浓度组(10,3,1μg·ml-1);机制研究部分将HepG2细胞分为对照组、模型组、地奥心血康组(10μg·ml-1)、Compound C ( 10μM)组、CompoundC (10 μM) + 地奥心血康组(10μg·ml-1),细胞按照分组分别加入药物孵育2h后，除对照组外，其余各组加入1 mM油酸-棕榈酸(oleic acid-palmitic acid,OA-PA,OA∶ PA=2∶1)刺激 24h 建立脂质蓄积模型，测定各组细胞脂质和转氨酶水平;油红O染色观察各组细胞脂质蓄积水平;Western blot 法检测细胞 AMPK、p-AMPK、SREBP-1c、ACC、p-ACC 蛋白表达。<br>　　结果:<br>　　(1)与正常组比较，模型组大鼠血清TC、TG、LDL-C、ALT、AST、ALP、LDH及GGT水平显著升高;肝脏指数及肝脏脂质(TC、TG、FFA)含量显著升高;NAS评分结果及脂肪阳染面积显著增加(P＜0.01)，电镜下显示细胞核及内质网等结构均有不同程度损伤，肝脏p-AMPK及p-ACC蛋白活化表达水平显著降低(P＜0.01)，SREBP-1c和ACC表达水平显著升高(P＜0.01)。与模型组相比，DXXK 组大鼠血清 TC、TG、LDL-C、ALT、AST、ALP、LDH 及 GGT 水平显著降低（P＜0.05）;肝脏指数降低，肝脏TC、TC、FFA水平显著下降;NAS评分结果及脂肪阳染面积显著降低（P＜0.05）;肝脏超微结构得到改善;肝脏p-AMPK及p-ACC蛋白活化表达水平显著升高（P＜0.05），SREBP-1c和ACC表达水平显著降低（P＜0.05）。<br>　　（2）在药效研究部分，与对照组细胞相比，模型组细胞TC、TG、转氨酶水平显著升高（P＜0.01）油红O染色显示脂质蓄积增多;细胞p-AMPK及p-ACC蛋白活化表达水平显著降低，ACC和SREBP-1c表达水平显著升高（P＜0.01）;与模型组细胞相比，DXXK和阿托伐他汀给药组细胞TC、TG、转氨酶水平显著降低（P＜0.05）;脂质蓄积水平显著降低;细胞p-AMPK及p-ACC蛋白活化表达水平显著升高，ACC和SREBP-1c表达水平显著降低（P＜0.05）。在机制研究部分，与对照组比较模型组与Compound C细胞TC、TG显著升高（P＜0.01）油红O染色显示脂质蓄积增多;模型组与Compound C组p-AMPK蛋白活化表达水平显著降低（P＜0.01）;与模型组比较，DXXK组细胞TC、TG水平显著降低（P＜0.01），油红O结果显示脂质蓄积减少;DXXK组p-AMPK蛋白活化表达水平显著升高，Compound C 组细胞 TC、TG 水平显著升高（P＜0.05），Compound C 组 p-AMPK蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）;与DXXK组比较，DXXK+Compound C组细胞TC、TG水平升高;p-AMPK蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），表明Compound C可减弱DXXK对AMPK的激活作用且AMPK被抑制时脂质蓄积程度上升。<br>　　结论:<br>　　（1） DXXK可改善NAFL;<br>　　（2） DXXK可以通过激活AMPK进而调节AMPK/SREBP-1 c/ACC通路，减少脂质合成进而改善NAFL。