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摘要目的:<br>　　白血病是一种较为常见的血液系统恶性肿瘤，白血病患者发病时常伴随一系列并发症，严重影响患者生活质量，危害患者生命健康。我国拥有丰富的中草药资源，从药用植物中寻找有效的中药成分用于缓解、治疗白血病受到科研人员的格外重视。小檗碱是传统中药黄连的有效成分，临床常用于消化系统相关疾病，大剂量单药使用时可以抑制多种白血病细胞系的增殖，联合化疗药物时同样可以发挥改善肿瘤药物抵抗的作用。本课题主要研究小檗碱(Berberine，BBR)与维奈托克(Venetoclax，VEN)联用诱导VEN耐药的人急性淋巴细胞白血病细胞株RS4;11(RS4;11-VENR)凋亡的作用及相关机制，同时也为中药成分联用化学药物发挥抗肿瘤活性提供思路。<br>　　方法:<br>　　1.小檗碱逆转RS4;11细胞VEN耐药的作用研究<br>　　对文献常报道的急性白血病细胞株进行细胞增殖实验以及抗凋亡蛋白表达水平的测试，最终以RS4;11细胞作为急性白血病细胞研究模型，另外通过小鼠RS4;11皮下移植瘤模型研究VEN慢性给药后发生耐药的分子机制。最后通过将人急性淋巴细胞白血病细胞株RS4;11连续暴露在VEN中获得RS4;11-VENR，并对基于耐药模型进行后续研究:<br>　　RS4;11-VENR耐药机制的验证:(1)MTS法测试VEN对RS4;11-VENR的增殖影响;(2)AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测VEN对RS4;11-VENR凋亡诱导作用;(3)Western blot法检测RS4;11-VENR抗凋亡蛋白水平变化;(4)qRT-PCR法检测RS4;11-VENR抗凋亡蛋白基因转录水平变化;(5)基于ZIP模型评价MCL-1抑制剂S63845与VEN在RS4;11-VENR的联用效果。<br>　　具有逆转耐药作用中药单体的筛选:(1)MTS法测试各中药单体单独处理对RS4;11-VENR的增殖影响;(2)CTG法测试各中药单体对人正常外周血单个核细胞(PBMC)毒作用;(3)基于ZIP模型评价各中药单体与VEN在RS4;11-VENR的联用效果。<br>　　2.小檗碱逆转RS4;11细胞VEN耐药的机制研究<br>　　(1)通过Hoechst33342/PI染色法镜下观察25μMBBR与1μM VEN联用凋亡诱导现象;(2)AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测两者联用对RS4;11-VENR凋亡诱导作用;(3)PI染色法检测两者联用对RS4;11-VENR细胞周期影响;(4)Western blot法检测两者联用对凋亡相关信号以及抗凋亡蛋白水平影响;(5)qRT-PCR法检测两者联用对RS4;11-VENR抗凋亡蛋白基因转录水平影响。<br>　　结果:<br>　　1.RS4;11-VENR具有临床报道MCL-1蛋白代偿性上调引发白血病患者VEN耐药的特征。细胞凋亡诱导和增殖抑制实验证明VEN对RS4;11-VENR不敏感(IC50＞10μM);Western blot结果表明RS4;11-VENR对比野生型RS4;11细胞存在MCL-1上调，qRT-PCR结果显示MCL-1基因转录水平同样存在上调，而MCL-1抑制剂与VEN联用有效逆转RS4;11-VENR耐药。<br>　　2.BBR与VEN联用协同抑制RS4;11-VENR细胞增殖。CTG法显示BBR对人PBMC无明显影响;基于ZIP模型的联用评价表明12～50μM BBR与0.1～10μM VEN协同抑制RS4;11-VENR细胞增殖。<br>　　3.BBR与VEN联用是通过线粒体途径诱导RS4;11-VENR细胞凋亡，BBR可以降低耐药细胞的MCL-1、BCL-XL蛋白水平。Hoechst33342/PI染色法、流式检测凋亡的结果显示25μM BBR与1μM VEN联用协同诱导细胞凋亡;Western blot结果显示BBR单独处理降低细胞MCL-1、BCL-XL蛋白水平下降;qRT-PCR实验结果显示25μM BBR单独处理细胞致MCL-1、BCL-XL基因表达水平降低。<br>　　结论:<br>　　BBR与VEN联用协同杀伤RS4;11-VENR细胞，BBR可能通过降低RS4;11-VENR细胞的MCL-1、BCL-XL蛋白水平，增加耐药细胞对VEN敏感性从而诱导凋亡发生。