新风胶囊通过circ--CBLB/miR--486--5p功能轴改善RA“炎症极化”状态的机制研究-论文-万方医学网

新风胶囊通过circ--CBLB/miR--486--5p功能轴改善RA“炎症极化”状态的机制研究

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摘要1目的 　　从临床研究、体外实验探讨circ-CBLB/miR-486-5p功能轴在类风湿关节炎(RA)中炎症极化和类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(RA-FLS)中异常增殖的作用机制，研究在新安医学“固本培元”理论基础下研制的“健脾化湿通络”中药新风胶囊(XFC)的干预作用。 　　2方法 　　2.1临床研究 　　纳入的30例健康者(HC组)来自安徽省中医院体检中心;纳入的60例RA患者来自安徽中医药大学第一附属医院，按照随机数字表分为30例对照组和30例观察组。采用相关仪器检测免疫炎症指标;采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测炎症细胞因子;采用流式细胞术(FCM)检测巨噬细胞标志物;采用实时荧光定量法(RT-qPCR)检测通路基因表达量;疾病活动评分采用VAS评分和DAS28评分;采用分级量化评估关节症状和脾虚证候积分。应用网络药理学中蛋白互作(PPI)和共同靶点富集(GO、KEGG)来分析XFC改善RA的可能机制，采用ACR20/50/70评估临床疗效，观察XFC治疗后RA患者的临床疗效、免疫炎症、细胞因子、炎症极化标志物、通路基因水平、疾病活动相关指标、关节症状和脾虚证候积分的变化，通过受试者曲线(ROC)来评估circ-CBLB和miR-486-5p对RA疾病活动度的预测效果。 　　2.2体外研究 　　双荧光素酶靶向验证circ-CBLB/miR-486-5p的结合关系。采用CCK8法检测细胞活力、采用流式细胞术检测细胞周期与凋亡、采用平板克隆检测细胞平板克隆形成能力、采用RT-qPCR检测相关基因表达、采用ELISA法检测相关细胞因子。首先通过细胞分组:(1)对照组;(2)模型组;(3)过表达组;(4)过表达空转组;(5)干扰组;(6)干扰空转组;(7)对冲组，来探讨circ-CBLB/miR-486-5p功能轴对RA-FLS增殖、凋亡的影响;然后通过XFC灌胃大鼠，通过CCK8法筛选XFC的最佳血清干预浓度，再通过细胞分组:(1)对照组;(2)模型组;(3)给药组;(4)过表达空转组;(5)过表达组;(6)过表达给药组，来探讨XFC含药血清是否可以通过调控circ-CBLB/miR-486-5p功能轴来对RA-FLS增殖、凋亡的影响。 　　3结果 　　3.1临床研究结果 　　3.1.1RA患者免疫炎症指标的变化 　　RA组免疫炎症水平显著高于与HC组(P＜0.01)，抗炎因子水平显著低于HC组(P＜0.01)。 　　3.1.2RA患者通路基因表达的变化 　　与HC组相比，RA组circ-CBLB表达水平明显下降（P＜0.01），miR-486-5p表达水平明显升高(P＜0.01)。 　　3.1.3RA患者巨噬细胞极化标志物表达水平的变化 　　与HC组相比，RA组M1型巨噬细胞标志物表达水平明显升高(P＜0.01)，M2型表达水平明显下降（P＜0.01）。 　　3.1.4RA患者通路基因与炎症极化标志物及免疫炎症之间的相关性 　　RA患者circ-CBLB表达水平与CD14+CD163+呈正相关，与miR-486-5p、CD14+CD86+呈负相关(P＜0.01);miR-486-5p表达水平与CD14+CD163+呈负相关，与CD14+CD86+呈正相关(P＜0.01);CD14+CD86+与CD14+CD163+呈负相关，ESR与circ-CBLB呈负相关（P＜0.01），与miR-486-5p、CD14+CD86+、CRP呈正相关(P＜0.01);CRP与circ-CBLB、CD14+CD163+呈负相关，与CD14+CD86+、ESR呈正相关(P＜0.05,P＜0.01)。 　　3.1.5RA患者通路基因与关节症状与脾虚证候积分之间的相关性 　　RA患者circ-CBLB表达水平与关节压痛、晨僵、少气懒言、食后腹胀积分呈负相关(P＜0.05，P＜0.01);miR-486-5p表达水平与关节压痛、食欲减退积分呈正相关(P＜0.05)。 　　3.1.6RA患者通路基因表达水平与RA患者疾病活动相关指标的关系 　　circ-CBLB的低水平和miR-486-5p的高水平表达对RA疾病活动度有一定的预测价值。 　　3.1.7XFC与RA的交集靶点 　　黄芪16种，雷公藤28种，薏苡仁5种，蜈蚣10种，预测作用靶点黄芪290个，雷公藤282个，薏苡仁30个，蜈蚣35个，RA疾病靶点基因4165个，共同靶点175个。 　　3.1.8PPI网络构建及炎症极化相关靶点筛选 　　将175个潜在作用靶点导入STRING数据库，获得一个由172个节点，3788条边组成的核心作用靶点网络。 　　3.1.9XFC与RA交集靶点KEGG和GO富集分析 　　KEGG和GO富集分析:GOBP富集在细胞对氮化合物的反应、对激素的反应等;GOMF富集在DNA结合转录因子、RNA聚合酶Ⅱ等;GOCC富集在膜微区、等离子膜筏等;KEGG富集的通路主要有免疫系统中的肿瘤坏死因子、趋化因子、破骨细胞分化相关信号通路等。 　　3.1.10两组RA患者临床疗效比较 　　观察组在ACR70改善率(66.7％)方面显著优于对照组(26.7％)（P＜0.01)。 　　3.1.11两组免疫炎症相关指标变化比较 　　与治疗前相比，两组ESR、CRP、RF、Anti-CCP-Ab表达水平均降低(P＜0.01);治疗后相比，观察组降低ESR、CRP、RF、Anti-CCP-Ab水平更明显（P＜0.01）。 　　3.1.12两组细胞因子相关指标变化比较 　　与治疗前相比，两组治疗后的抗炎因子IL-4、IL-10含量升高(P＜0.05，P＜0.01)，促炎因子IL-6、TNF-α水平均降低(P＜0.01)。治疗后比较，观察组抗炎因子IL-4、IL-10水平升高较对照组更明显(P＜0.01)，促炎因子IL-6、TNF-α水平降低较对照组明显(P＜0.05）。 　　3.1.13两组通路基因相关指标比较 　　与治疗前比较，两组miR-486-5p表达降低明显(P＜0.01)、circ-CBLB表达升高明显(P＜0.01);治疗后比较，观察组miR-486-5p表达降低较更明显(P＜0.01)，circ-CBLB表达升高更明显(P＜0.01)。 　　3.1.14两组巨噬细胞极化标志物比较 　　与治疗前比较，两组CD14+CD86+表达比例降低明显(P＜0.05，P＜0.01)、CD14+CD163+表达比例升高明显(P＜0.01);治疗后比较，观察组CD14+CD86+表达比例降低更明显（P＜0.01），CD14+CD163+表达比例升高更明显（P＜0.01）。 　　3.1.15两组疾病活动相关指标比较 　　与治疗前相比，两组降低VAS、DAS28评分明显(P＜0.01);治疗后相比，观察组降低VAS、DAS28评分较对照组更明显(P＜0.01)。 　　3.1.16两组关节症状、脾虚证侯积分比较 　　与治疗前相比，对照组患者关节症状积分显著降低(P＜0.01)，脾虚证候积分差异无统计学意义(P＞0.05);观察组关节症状、脾虚证候积分均降低（P＜0.01）。治疗后相比，观察组在降低患者关节症状积分、脾虚证候积分均优于对照组（P＜0.01）。 　　3.2体外研究结果 　　3.2.1双荧光素酶报告 　　双荧光素酶报告示:circ-CBLB与miR-486-5p的3''UTR区域有结合位点。 　　3.2.2circ-CBLB对RA-FLS细胞活力的影响 　　同一时间与模型组细胞活力比较，过表达组细胞活力降低(P＜0.01),干扰组升高(P＜0.01）。 　　3.2.3circ-CBLB对RA-FLS细胞凋亡的影响 　　与模型组相比，过表达组凋亡率升高(P＜0.01)，干扰组凋亡率降低(P＜0.01)。 　　3.2.4circ-CBLB对RA-FLS细胞周期的影响 　　与模型组相比，过表达组S+G2期的比例升高(P＜0.01)，干扰组S+G2期的比例降低(P＜0.01)。 　　3.2.5circ-CBLB对RA-FLS平板克隆形成能力的影响 　　与模型组相比，过表达组克隆形成率降低(P＜0.01），干扰组克隆形成率升高(P＜0.01)。 　　3.2.6circ-CBLB对miR-486-5p的影响 　　与模型组相比，过表达组miR-486-5p表达水平降低(P＜0.01），干扰组miR-486-5p表达水平升高（P＜0.01）。 　　3.2.7circ-CBLB对细胞炎症因子的影响 　　与模型组相比，过表达组的抗炎因子IL-4、IL-10水平升高，促炎因子IL-6、TNF-α水平降低(P＜0.05，P＜0.01);干扰组TNF-α水平升高(P＜0.01）。 　　3.2.8XFC最佳血清浓度的确定 　　XFC干预RA-FLS的最佳含药血清浓度为20.0％，最佳干预时间为72h。 　　3.2.9circ-CBLB过表达状态下XFC含药血清对RA-FLS细胞活力的影响 　　与模型组同一时间相比，给药组、过表达组、过表达给药组的细胞活力均下降(P＜0.01);与过表达组相比，给药组、过表达给药组的细胞活力均下降(P＜0.01)。 　　3.2.10circ-CBLB过表达状态下XFC含药血清对RA-FLS细胞凋亡的影响 　　与模型组比较，给药组、过表达组、过表达给药组的凋亡率均升高（P＜0.01）;与过表达组比较，给药组、过表达给药组凋亡率升高，余组均降低(P＜0.01）。 　　3.2.11circ-CBLB过表达状态下XFC含药血清对RA-FLS细胞周期的影响 　　与模型组比较，过表达组、给药组、过表达给药组的S+G2期比例均升高(P＜0.01);与过表达组比较，给药组、过表达给药组S+G2期比例升高，余组均降低(P＜0.01)。 　　3.2.12circ-CBLB过表达状态下XFC含药血清对circ-CBLB和miR-486-5p的影响 　　circ-CBLB方面:与模型组比较，给药组、过表达组、过表达给药组基因水平升高（P＜0.01）;与过表达组比较，过表达给药组基因水平升高，余组均降低(P＜0.01);与过表达给药组比较，余组均降低(P＜0.01);miR-486-5p方面:与模型组比较，给药组、过表达组、过表达给药组基因水平降低(P＜0.01);与过表达组比较，对照组、给药组、过表达给药组基因水平降低，余组均升高(P＜0.05，P＜0.01)。 　　3.2.13XFC含药血清对细胞炎症因子的影响 　　与模型组相比，给药组、过表达组、过表达给药组的抗炎因子IL-4、IL-10含量升高(P＜0.05，P＜0.01)，促炎因子IL-6、TNF-α含量降低(P＜0.01);与过表达组比较，给药组的IL-4、IL-6、IL-10差异无统计学意义（P＞0.05），TNF-α含量降低(P＜0.01);过表达给药组的IL-4、IL-10含量升高(P＜0.01)，IL-6、TNF-α含量降低(P＜0.05，P＜0.01)。 　　4结论 　　4.1XFC可以改善炎症极化状态和脾虚证候，提高临床疗效 　　XFC对于提高RA的临床疗效、调节circ-CBLB、miR-486-5p及M1、M2型巨噬细胞炎症极化标志物的表达，来平衡患者炎症极化状态，在改善RA的免疫炎症、疾病活动度、关节症状、脾虚证候方面具有显著优势。 　　4.2XFC含药血清可以通过circ-CBLB/miR-486-5p调控RA-FLS相关功能 　　XFC的含药血清可以调控circ-CBLB/miR-486-5p功能轴，可以提高circ-CBLB的表达，抑制miR-486-5p的表达，在抑制RA-FLS的细胞活力、提高细胞凋亡率、延长细胞周期、提高抗炎因子，降低促炎因子方面优于circ-CBLB的正表达。