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摘要目的:<br>　　2A蛋白酶(2Apro)是人类肠道病毒71型(Enterovirus71，EV71)编码的一种辅助蛋白，在调节EV71感染、病毒复制和病毒侵袭中发挥重要作用。2Apro可以通过切割黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)和接头蛋白线粒体抗病毒信号(MAVS)分子进而抑制IRF3、NF-κB等转录因子激活，减少和阻断干扰素(IFN)和细胞因子产生，从而利于病毒的免疫逃避。然而，2Apro如何被宿主因素降解尚不清楚。本研究发现2Apro是宿主E3泛素连接酶斑点型POZ蛋白(SPOP)的底物蛋白。SPOP可以与EV71-2Apro相互作用，并以剂量依赖性的方式下调EV71-2Apro的蛋白水平。进一步研究表明SPOP可以通过诱导EV71-2AproK48连接的多聚泛素化水平介导EV71-2Apro的溶酶体依赖性降解，最终抑制EV71的感染。我们的研究结果揭示SPOP对EV71编码的2Apro泛素化降解及抑制EV71感染的机制，这可能为治疗EV71提供新的策略。<br>　　方法:<br>　　(1)采用免疫共沉淀实验(Co-IP)检测SPOP和EV71-2Apro之间的相互作用;通过Mapping技术和点突变技术，构建SPOP缺失功能结构域突变质粒和点突变质粒，确定SPOP对EV71-2Apro的相互作用区域;过表达SPOP和EV71-2Apro，采用共聚焦显微镜技术分析SPOP与EV71-2Apro共定位水平。<br>　　(2)过表达或敲低SPOP，采用WesternBlot或RT-qPCR技术分析SPOP对EV71-2Apro的蛋白水平和mRNA水平影响;利用蛋白质合成抑制剂(CHX)，采用WesternBlot技术分析SPOP对EV71-2Apro蛋白稳定性的影响。<br>　　(3)利用蛋白酶体抑制剂(MG132)和溶酶体抑制剂(MA)，采用WesternBlot技术确定SPOP介导的EV71-2Apro降解途径;采用Co-IP实验检测SPOP对EV71-2Apro泛素化影响及泛素化类型;过表达SPOP缺失功能结构域突变质粒，采用Co-IP实验确定SPOP对EV71-2Apro的调控是否依赖于E3泛素连接酶活性。<br>　　(4)对Flag-2A质粒采用原核表达及诱导纯化技术获得EV71-2Apro抗体;通过EV71感染细胞并编码2Apro;通过过表达或敲低SPOP，采用Westernblot和Co-IP技术分析SPOP对EV71编码的2Apro的调控作用。<br>　　(5)通过过表达或敲低SPOP，采用Westernblot、RT-qPCR和病毒上清滴度检测技术分析SPOP对EV71的影响;通过过表达或敲低SPOP，采用Westernblot、RT-qPCR和滴度检测技术分析SPOP对甲型流感病毒(H1N1)、水泡性口炎病毒(VSV)和单纯疱疹病毒(HSV)的影响。<br>　　(6)采用RT-qPCR分析H1N1、VSV和HSV对去泛素化酶USP24mRNA水平的影响;采用Co-IP实验检测USP24对TBK1K69、K154和K372位点的泛素化及K63类型泛素化的影响。<br>　　结果:<br>　　(1)发现SPOP蛋白存在与EV71-2Apro相互作用的氨基酸序列;SPOP与EV71-2Apro存在相互作用;SPOP与EV71-2Apro在细胞内共定位。<br>　　(2)SPOP显著下调EV71-2Apro的蛋白水平，而不影响EV71-2Apro的转录水平;此外，SPOP降低EV71-2Apro的稳定性。<br>　　(3)SPOP通过溶酶体途径降解EV71-2Apro;SPOP促进EV71-2AproK48类型多聚泛素化修饰进而降解EV71-2Apro;SPOP对EV71-2Apro调控依赖其E3泛素连接酶活性。<br>　　(4)SPOP显著下调EV71编码的2Apro;EV71编码的2Apro与SPOP存在相互作用，并促进EV71-2AproK48类型多聚泛素化修饰。<br>　　(5)SPOP相对特异性的影响EV71的感染而不影响H1N1、VSV和HSV感染。<br>　　(6)EV71相对特异性诱导USP24的表达;EV71感染时去泛素化酶USP24通过去除TBK1K154位点K63类型多聚泛素化来抑制干扰素信号通路。<br>　　结论:<br>　　宿主E3泛素连接酶SPOP可与EV71-2Apro相互作用，并通过诱导EV71-2Apro的K48多聚泛素化而促进2Apro的降解，最终负向调控EV71的感染。而EV71感染时可相对特异性诱导去泛素化酶USP24且通过去除TBK1K154位点K63类型多聚泛素化来抑制干扰素信号通路。本研究加深了人们对宿主蛋白调控EV71感染和EV71劫持宿主蛋白促进感染的理解，也为临床防治EV71感染提供潜在策略。