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摘要目的：<br>　　姜科植物海南砂Wurfbainia longiligularis与阳春砂 Wurfbainia villosa.均为砂仁的来源植物，其药用部位为成熟干燥果实，具有芳香化湿和辛温行散功效，其中果实富含多种单萜类药效成分，如乙酸龙脑酯、龙脑、樟脑、莰烯及蒎烯等，其中乙酸龙脑酯是其在中国药典的质量指标性成分。课题组已经从阳春砂基因组中鉴定出萜类合酶(terpene synthase,TPS)基因家族66个成员，并对其中18个TPS进行了催化功能鉴定，并且获得了负责合成砂仁主要药效成分乙酸龙脑酯前体的关键酶——龙脑基二磷酸合酶(bornyl diphosphate synthase，BPPS)，同时在海南砂中也鉴定了能催化生成龙脑基二磷酸(bornyl diphosphat,BPP)的TPS (WlTPS24)，但其催化生成BPP的活性较弱，推测海南砂中可能存在其他能够催化产生BPP的TPS，且前期还未从基因组水平整体对海南砂TPS基因进行筛选和研究，因此基于转录组和基因组数据对海南砂TPS基因家族进行鉴定并与阳春砂TPS基因进行比较分析，以期增加对海南砂与阳春砂两者萜类合酶基因家族的认识，分析不同药用砂仁中萜类种类及含量差异与TPS相关的分子基础，为改进砂仁种质及合成萜类等药用有效成分提供理论依据。<br>　　方法：<br>　　1海南砂TPS基因家族鉴定及与阳春砂TPS基因家族的进化分析<br>　　通过在Pfam蛋白数据库检索TPS所对应的隐马尔可夫模型(hidden Markov models,HMM)，在海南砂基因组数据库的注释信息中进行筛选，将所获得的基因在转录组数据库中进行本地blast,进一步筛选出具有保守motif和完整开放阅读框的海南砂TPS基因家族，并命名为WlTPS。用TBtools的MUSCLE工具构建WlTPS与WvTPS的系统进化树，使用在线工具iTOL (https://itol.embl.de/)对系统进化树进行美化。<br>　　2WlTPS的染色体定位、结构域可视化、表达量热图分析<br>　　分别使用TBtool软件的染色体定位功能模块和热图分析模块对WlTPS基因家族进行染色体定位和表达量热图分析，使用MEME在线网站(http://meme-suite.org/tools/meme)对WlTPS基因家族的结构域进行分析，将分析所获得的MEME文件用TBtool结构域分析模块进行可视化和美化。<br>　　3候选WlTPS基因的筛选、克隆与功能鉴定<br>　　筛选与已鉴定的阳春砂WvTPS,特别是与WvBPPS聚类关系较近且表达量较高或具有器官特异性的WlTPS作为候选基因。以候选基因所在表达量较高的器官部位cDNA作为模板进行克隆，使用原核表达体系对融合蛋白进行诱导，纯化后的蛋白以香叶基焦磷酸( geranyl pyrophosphate，GPP)为底物进行体外酶促反应，对可能催化生成BPP的纯化蛋白以GPP为底物反应后加入碱性磷酸酶进行脱磷酸处理，GC-MS检测其催化产物。<br>　　4与BPPS相关基因的实时荧光定量PCR<br>　　根据基因序列设计用于qPCR的特异性引物，以海南砂不同组织部位的根、根状茎、茎、叶、花和果实(开花后60天)及阳春砂种子团的cDNA为模板进行qRT-PCR,基因表达水平以2-△△CT进行归一化处理，数据用GraphPad prism软件进行作图展示。<br>　　5 WlBPPS与WvBPPS酶动力学分析<br>　　取酶的最适反应时间和蛋白浓度，在一定范围的底物浓度梯度下对WlBPPS和WvBPPS进行体外酶活检测，用GC-MS检测其催化产生龙脑的含量，产物浓度用外标法确定。通过GraphPad Prism 8.0软件计算酶动力学参数。<br>　　6 WlTPS24与WvBPPS突变体的构建及功能鉴定<br>　　结合课题组前期对WvBPPS与底物结合的活性口袋分析结果，选取未进行突变验证的位点进行定点突变，体外酶活检测方法如2.3所示。<br>　　7海南砂与阳春砂蒎烯合酶的比较分析<br>　　从UniProt (https://www.uniprot.org/)在线网站下载已发表的蒎烯合酶(Pinene synthase,PS)氨基酸序列，与WlPS和WvPS进行序列比对，并对PS关键位点进行预测。结合本课题组已有的海南砂与阳春砂转录组数据及萜类含量数据对WlPS和WvPS的表达量及各组织部位蒎烯含量进行相关性分析。<br>　　结果：<br>　　1海南砂TPS基因家族鉴定及生物信息分析<br>　　筛选获得了 75个具有全长CDS的WlTPS候选序列。75个WlTPS和66个WvTPS被分为 5 个 TPS 亚家族:TPS-a,TPS-b,TPS-c,TPS-e/f 和 TPS-g。75 个 WlTPS 分布在13条染色体上，共有14个串联重复基因簇，有15个基因可能发生了片段复制事件。<br>　　2参与海南砂主要单萜类成分合成的候选基因筛选、克隆与功能鉴定<br>　　根据聚类关系及转录组表达谱信息，在TPS-b亚家族筛选到15个WlTPS候选基因，成功克隆和鉴定了其中11个WlTPS的催化功能:WlTPS5和WlTPS8为蒎烯合酶;WlTPS21 和 WlTPS33 为罗勒烯合酶;WlTPS26、WlTPS28、WlTPS30 具有生成 BPP的功能，其中WlTPS30以BPP为主产物;WlTPS32生成蒎烯和柠檬烯;WlTPS35为芳樟醇合酶;WlTPS36和WlTPS51为双功能合酶，分别催化GPP和FPP生成芳樟醇和橙花叔醇。<br>　　3与BPPS相关基因的表达模式分析<br>　　WlTPS26和 WlTPS28在花中特异性表达，WlTPS24主要在茎中表达，WlBPPS主要在种子团和花中表达。WvBPPS在种子团中的表达量远高于WlBPPS,而WlTPS24、WlTPS26和WlTPS28几乎不在种子团中表达。<br>　　4 WlBPPS与 WvBPPS酶动力学分析<br>　　WlBPPS和WvBPPS酶动力学分析结果显示WvBPPS的Km值较小，其与底物的亲和力更高，但WlBPPS的Kat/Km低于WvBPPS,表明WlBPPS相对于 WvBPPS对GPP有较好的专一性。<br>　　5 WlTPS24和WvBPPS突变体的构建与功能鉴定<br>　　根据本课题组前期对WvBPPS关键位点的分析结果，获得了一个靠近TPS的保守motif “DTE”的位点V455，构建了WvBPPS的突变体V455R。另外根据前期WvBPPS的突变体V450A构建了突变体V450I,同时也将WlTPS24此位点的“I”突变为“ V”，构建突变体I450V。催化结果显示V450I活性明显降低，而V455R失去催化活性。但WlTPS24的突变体I450V的催化活性与野生型相比无明显差异。<br>　　6海南砂与阳春砂蒎烯合酶PS的比较分析<br>　　本研究除了对海南砂与阳春砂的BPPS进行比较外，也对两个物种的PS进行了比较。WlAPS (α-Pinene synthase,APS)、WlBPS (β-Pinene synthase,BPS)、WvAPS和WvBPS的氨基酸序列整体一致性为98.33 ％。主产物为α-蒎烯的WlAPS和WvAPS的α-蒎烯合酶关键位点与具有α-蒎烯产物高选择性的α-蒎烯合酶PlAPS[1](来源于芍药 Paeonia lactiflora) 一致。结合 WlAPS、WlBPS、WvAPS 和 WvBPS 的产物及其在海南砂与阳春砂各组织部位表达模式，推测WlAPS和WvAPS可能是海南砂与阳春砂果皮、种子团和花中负责α-蒎烯合成的关键酶，WlBPS与WvBPS可能是果皮与花中主要负责β -蒎烯合酶合成的关键酶。<br>　　结论：<br>　　本研究首次鉴定了海南砂的TPS基因家族，并对属于TPS-b亚家族的11个WlTPS进行了体外酶活功能鉴定，其中包括了主要负责海南砂BPP合成的关键酶WlBPPS,及其他两个具有生成BPP功能的WlTPS26和WlTPS28。本文首次对海南砂与阳春砂TPS基因家族进行了聚类分析并从氨基酸序列差异、酶动力学、催化产物及表达模式等多方面对海南砂与阳春砂的BPPS和PS进行了比较分析，为更全面认识海南砂与阳春砂单萜类药效成分合成途径的关键TPS及砂仁种质的分子改良提供了参考。