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摘要目的探讨tRF-3023b在缓解炎症反应中的作用及其潜在的机理。<br>　　方法1.用脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)(500ng/mL)刺激RAW264.7细胞2h,再用草乌甲素(BulleyaconitineA,BLA)(150μg/mL)处理细胞。在各相应时间点收集细胞上清，酶联免疫吸附测定(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)法检测炎症细胞因子(包括IL-6、TNF-α和MCP-1)的水平。Westernblot检测炎性相关蛋白(P65、iNOS、COX-2)的表达。RNA-seq检测BLA处理的RAW264.7细胞12h的tRNA来源的片段(tRNADerivedFragments,tRFs)表达谱，并对差异表达tRFs(DE-tRFs)进行qPCR验证。首先通过生物信息学方法预测DE-tRFs的靶基因并进行GO分类和KEGG信号通路富集。2.以tRF-3023b为目的基因进行后续研究。合成tRF-3023bmimic和inhibitor序列，转染RAW264.7细胞。流式细胞术分析细胞周期和凋亡情况;ELISA检测培养液上清中的炎症细胞因子的水平;Westernblot法检测炎性相关蛋白的表达。3.利用双荧光素酶报告系统验证tRF-3023b与RNApulldown+质谱检测到的靶基因Cul4a3''-UTR的结合情况。分别构建Cul4a基因过表达/敲低慢病毒载体，并分别与tRF-3023bmimic/inhibitor共转染LPS处理的RAW264.7细胞。流式细胞术分析细胞周期和凋亡;ELISA检测培养液上清的炎症细胞因子水平;Westernblot检测炎性相关蛋白的表达。<br>　　结果1.BLA能有效抑制炎性细胞中炎症因子的水平，并显著抑制了炎性相关蛋白的表达。RNA-seq共获得了9个差异表达的tRFs,包括5个上调(tRF-58∶75-His-GTG-2-M2、tRF-59∶75-His-GTG-2-M2、tRF-1∶29-His-GTG-2、tRF-1∶32-Lys-TTT-1和tRF-1∶30-Lys-TTT-1)和4个下调(tRFtRF-1∶29-Lys-CTT-2、tRF-1∶29-chrM.Ile-GAT、tRF-1∶16-Glu-TTC-1和tRF-+1∶T22-Asp-GTC-1-11);qRT-PCR证实tRF-1∶16-Glu-TTC-1、tRF-1∶29-chrM.Ile-GAT、tRF-58∶75-His-GTG-2-M2(tRF-3023b)表达趋势与测序结果相一致，因此后续选择tRF-3023b作为目的基因进行深入研究。对所有DE-tRFs靶基因的预测和GO分析表明，这些靶基因主要与生物过程(BP)中的“Cellularprocess”等、细胞组分(CC)中的“Cellularanatomicalentity”等、分子功能(MF)中的“Binding”等相关。KEGG信号通路的富集结果显示，差异表达tRFs的靶基因主要富集于“NF-κBsignalingpathway”、“RASsignalingpathway”和“Regulationofactincytoskeleton”等。<br>　　2.tRF-3023binhibitor/mimic瞬时转染RAW264.7细胞后，RT-qPCR结果表明，tRF-3023bmimic增强了tRF-3023b的表达，而tRF-3023binhibitor则抑制了其表达。细胞周期结果显示，与NCmimic组相比，tRF-3023bmimic组在S期的细胞显著升高(P＜0.05);而G2/M期的细胞分布则明显降低(P＜0.05)。这说明tRF-3023bmimic使炎性细胞阻滞于S期。相比于NCinhibitor组,tRF-3023binhibitor组G1期、S期和G2/M期的细胞分布均无显著差异(P＞0.05)。凋亡结果显示，与NCmimic组相比，tRF-3023bmimic组细胞凋亡的比例显著增加(P＜0.05)。而tRF-3023binhibitor组细胞凋亡的比例与NCinhibitor组相比无明显差异(P＞0.05)。ELISA结果表明，与NCmimic组相比，tRF-3023bmimic组显著降低炎症因子(IL-6、TNF-α和MCP-1)的表达;同样，tRF-3023binhibitor组与NCinhibitor相比，结果无明显差异。Westernblot结果表明，tRF-3023bmimic与NCmimic组相比会显著降低相关蛋白(P65、COX-2、iNOS)的表达;而tRF-3023binhibitor组与NCinhibitor相比，无明显差异。<br>　　3.双荧光素酶报告系统检测结果表明,tRF-3023b与Cul4amRNA的3''-UTR区直接结合;并经RNApulldown+质谱结果进一步证实。RT-qPCR结果表明，与shCtrl组相比，shCul4a组中Cul4a的表达量下调了0.52±0.02倍(P＜0.01)，而其在OE-Cul4a组的表达量相比于OE-Ctrl组则明显升高到2.081±0.074倍(P＜0.01）。细胞周期检测结果显示，与OE-Ctrl组相比较，OE-Cul4a组S期的细胞分布显著降低(P＜0.001)，而G2/M期的细胞分布则明显升高(P＜0.001)。这表明Cul4a过表达导致炎性细胞阻滞于G2/M期。但相比于shCtrl组，shCul4a组G1期和S期的细胞分布均显著升高(分别P＜0.01和P＜0.05)，而G2/M期的细胞分布则明显降低(P＜0.01)。这表明Cul4a沉默导致炎性细胞阻滞于G1期和S期。凋亡结果显示，与OE-Ctrl组相比较，OE-Cul4a组凋亡细胞的比例明显下降(P＜0.001）;但shCul4a组凋亡细胞的比例相比于shCtrl组则显著升高(P＜0.001)。ELISA结果表明，OE-Cul4a组炎症因子的表达显著高于OE-Ctrl组;而shCul4a组炎症因子的表达则显著低于shCtrl组。Westernblot结果表明，相比于OE-Ctrl组，OE-Cul4a组中炎性相关蛋白的表达显著增加;而shCul4a组炎性相关蛋白的水平明显低于shCtrl组(P＜0.01)。最后，通过Cul4a与tRF-3023b共转染后的ELISA和Westernblot的结果表明，tRF-3023bmimic会显著抑制Cul4a过表达引起的促炎作用;使细胞周期恢复到原有水平;凋亡细胞的比例也有所下降。<br>　　结论<br>　　1.BLA显著抑制炎性因子和炎性相关蛋白的表达并通过NF-κB信号实现的。<br>　　2.tRF-3023b也可抑制细胞因子和炎性相关蛋白的表达并通过NF-κB信号实现的。<br>　　3.Cul4a促进了细胞因子和炎性相关蛋白的表达。<br>　　4.Cul4a是tRF-3023b的靶基因之一，tRF-3023b的抗炎作用通过抑制Cul4a的表达进而抑制NF-κB信号实现的。