检索历史 清除

摘要研究背景<br>　　糖尿病肾病(Diabetickidneydisease,DKD)是糖尿病最严重的并发症之一，也是导致终末期肾病的主要病因。不仅如此，糖尿病相关慢性肾脏病也已成为导致我国慢性肾脏病的首要病因。目前，DKD的治疗方案主要围绕降低血糖、血脂和控制血压来进行，临床治疗中仍然缺乏特异性的治疗策略。足细胞损伤是DKD进展的关键细胞事件，也是导致蛋白尿和肾小球硬化的重要因素。因此，预防足细胞损伤并改善其功能是治疗DKD的重要环节和研究热点。然而，足细胞损伤的机制非常复杂且尚不明确，目前的研究主要聚焦在氧化应激、炎症反应、脂代谢和自噬等方面。如今针对足细胞损伤研发的药物对足细胞结构和功能的修复效果十分有限，且安全性不可靠。因此，进一步探索足细胞损伤机制，寻找特异性有效的治疗策略对于DKD的防治具有非常重要的理论意义和应用前景。<br>　　血管生成素样蛋白(angiopoietin-likeproteins，ANGPTLs)家族是一类分泌型的糖蛋白，不仅与血管生成有关，在炎症反应、糖脂代谢、肿瘤发生和转移过程中也发挥重要作用。值得注意的是，ANGPTLs家族的多位成员与肾脏疾病密切相关。因此，深入探讨该家族成员与DKD的关系会为揭示该病特点和发现新颖治疗策略提供新线索。血管生成素样蛋白8(angiopoietin-likeproteins8,ANGPTL8)是ANGPTLs家族中一类非典型新成员，其结构特征为缺少该家族典型成员的C端纤维蛋白原结构域，不需要切割便具有活性。ANGPTL8在人类肝脏和脂肪组织中高表达，在胎盘、肾脏、血管等多种组织中也均有表达。循环中的ANGPTL8可抑制脂蛋白酯酶的活性，参与脂质代谢，与各种代谢性疾病的严重程度呈正相关，可作为一种潜在的生物标记物。除了在血液循环中的作用模式，值得关注的是，ANGPTL8还具有调控胞内信号转导的功能，在炎症反应、自噬和凋亡等多种病理过程中发挥重要作用。近期的临床研究发现，2型糖尿病并伴有蛋白尿的患者血清及尿液中ANGPTL8表达显著升高，并与肾小球滤过率呈负相关，这表明ANGPTL8与DKD的肾损伤有密切关系，但作用及机制尚不明确。本研究将进一步明确AGNPTL8在DKD足细胞损伤中的作用。在机制上，我们发现ANGPTL8可能通过Wnt/β-catenin信号通路来实现对足细胞损伤的调控。<br>　　研究目的<br>　　(1)建立STZ/HFD诱导的2型DKD小鼠模型，验证肾脏及血清中ANGPTL8的表达情况。<br>　　（2）研究ANGPTL8在DKD足细胞损伤中的作用。<br>　　（3）初步探讨ANGPTL8在足细胞损伤中的作用机制。<br>　　研究方法与结果<br>　　第一部分:ANGPTL8在糖尿病肾病中的表达模式<br>　　1.成功制备STZ/HFD诱导的糖尿病肾病小鼠模型<br>　　（1）用低浓度STZ联合HFD制备经典的2型DKD小鼠模型<br>　　（2）检测STZ/HFD诱导的DKD模型组小鼠生理及生化指标，结果显示，模型组小鼠空腹血糖、胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇均显著升高，体重降低，肾重体重比增加。<br>　　（3）收集小鼠尿液，检测尿白蛋白/肌酐比（UACR），结果显示，模型组小鼠蛋白尿显著增加，说明DKD模型制备成功。<br>　　（4）PAS染色检测肾脏肾小球形态变化和硬化程度，结果发现，模型组小鼠出现明显的肾小球系膜增生和肾小球硬化。<br>　　（5）利用透射电镜（TEM）检测肾小球超微结构，结果发现，模型组小鼠出现明显的肾小球基底膜增厚、足突数量减少及足突宽度增加。<br>　　2.糖尿病肾病小鼠模型中ANGPTL8的表达情况<br>　　（1）免疫磁珠法分离肾小球，光镜观察肾小球样品纯度大于98％。<br>　　（2）收集分离的肾小球进行转录组测序，分析差异表达基因。根据聚类分析数据绘制ANGPTLs家族热图。结果显示，模型组小鼠肾小球中ANGPTL8基因表达水平升高最明显。<br>　　（3）通过实时定量RT-PCR验证测序结果。结果显示，模型组小鼠肾小球中Angptl2,Angptl3,Angptl4,Angptl8mRNA水平均明显升高，其中Angptl8的升高最为显著。<br>　　（4）使用Westernblot及免疫组化染色检测STZ/HFD小鼠肾皮质中的表达情况，结果显示，模型组小鼠肾皮质中ANGPTL8的蛋白水平均显著升高，且多集中在肾小球部位。<br>　　（5）使用足细胞标志物WT-1与ANGPTL8进行免疫荧光双标实验，共聚焦显微镜观察显示，ANGPTL8在STZ/HFD小鼠肾小球的足细胞中表达水平升高。<br>　　3.ANGPTL8在糖尿病肾病小鼠血清中的表达情况<br>　　ELISA检测STZ/HFD诱导的DKD模型小鼠的血清样本，结果显示，模型组小鼠血清中ANGPTL8水平明显升高。<br>　　4.检测ANGPTL8在临床患者肾组织标本中的表达水平<br>　　(1)获取DKD患者及其他肾小球疾病患者如局灶性节段性肾小球硬化症(focalsegmentalglomurularsclerosis,FSGS)、IgA肾病、微小病变肾病(Minimal-changedisease,MCD)和膜性肾病(membranousnephropathy，MN)的肾穿刺活检标本的病理切片。<br>　　(2)采用免疫组化染色检测ANGPTL8在肾组织中的分布和表达变化。<br>　　5.体外模拟糖尿病肾病条件检测足细胞中ANGPTL8的表达情况<br>　　(1)普通RT-PCR检测发现，肾脏多种实质细胞中均检测到Angptl8的表达。<br>　　(2)用HG处理足细胞，实时定量RT-PCR及Westernblot检测足细胞中ANGPTL8的mRNA及蛋白水平，结果显示ANGPTL8在足细胞中表达显著增加。<br>　　第二部分:ANGPTL8在糖尿病肾病足细胞损伤中的作用与机制<br>　　1.成功构建足细胞特异性ANGPTL8基因敲除小鼠<br>　　(1)动物模型构建:采用Cre-Loxp重组系统制备Angptl8flox/+小鼠，并与Podocin-Cre小鼠杂交，构建足细胞特异性ANGPTL8基因敲除小鼠(Podocin-Cre+/Angptl8fl/fl)。提取鼠尾DNA鉴定小鼠基因型。结果显示，Podocin-Cre+/Angptl8fl/fl小鼠，实现了足细胞中特异性敲除ANGPTL8。<br>　　(2)免疫荧光染色初步验证ANGPTL8在肾小球中的敲除情况<br>　　2.ANGPTL8基因沉默可以改善由高糖诱导的足细胞损伤<br>　　(1)在体外对足细胞转染ANGPTL8的小干扰RNA,使用RT-qPCR和Westernblot检测沉默效率，结果显示ANGPTL8沉默成功。<br>　　(2)通过CCK-8检测ANGPTL8基因沉默对足细胞活力的影响，结果显示，ANGPTL8基因沉默可以增加足细胞活性。<br>　　(3)Westernblot检测足细胞标志物Podocin的表达情况，结果显示沉默ANGPTL8后可以改善由HG处理导致的Podocin的降低。<br>　　(4)免疫荧光染色细胞骨架F-actin,可以发现ANGPTL8沉默后可以改善高糖诱导的细胞骨架重排。<br>　　(5)使用RT-qPCR检测炎症因子的变化情况，结果显示足细胞中沉默ANGPTL8后能明显改善由HG处理导致的炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β和ICAM-1表达的升高。<br>　　3.转录组测序结果分析ANGPTL8在足细胞损伤中调控的下游基因<br>　　结果发现，ANGPTL8基因沉默可以调控高糖诱导的足细胞中炎症相关基因、凋亡相关基因及Wnt/β-catenin信号通路相关基因的表达水平。<br>　　4.ANGPTL8正调控Wnt/β-catenin通路参与足细胞损伤<br>　　Westernblot检测足细胞中Wnt/β-catenin信号通路成员的变化。结果显示，基因沉默ANGPTL8可明显抑制高糖诱导的β-catenin的活化和GSK-3β在Ser9位的磷酸化水平。<br>　　结论与创新性<br>　　1.本研究首次发现ANGPTL8在STZ/HFD诱导的DKD动物模型的肾脏中和高糖诱导的足细胞中表达均明显升高。<br>　　2.本研究显示ANGPTL8基因沉默可减轻高糖诱导的足细胞损伤和炎症反应。<br>　　2.本研究首次发现ANGPTL8可能通过调控Wnt/β-catenin信号通路，促进DKD中足细胞损伤。