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摘要背景<br>　　子痫前期(preeclampsia，PE)是常见的妊娠相关疾病，发病率在全世界范围内为2-8％,以妊娠20周后新发的高血压(≥140/90mmHg)和蛋白尿(尿蛋白≥0.3g/24h)为主要特征，是导致孕产妇围产期死亡的重要原因。子痫前期的发病机制尚不明确，目前滋养细胞浅浸润、螺旋动脉重铸不足的假说被大多数学者接受，具体来说，即滋养细胞浅浸润引起螺旋动脉重铸不足，导致子宫和胎盘灌注不良，引起胎盘局部缺氧并产生氧化应激，使抗血管生成因子和炎性因子释放到母体血液循环中，引起母体全身广泛性内皮损伤和功能障碍，导致高血压和肾脏等多个器官功能异常。目前在子痫前期的临床诊疗中，除对症治疗外尚缺乏有效防治靶标药物，一旦病情进展，除及时终止妊娠外，尚无其他有效治疗措施。因此，深入阐明子痫前期发病机制并筛选有效的诊疗靶标分子对于其精准诊断和治疗具有重要意义。<br>　　骨形态发生蛋白(Bonemorphogeneticproteins，BMPs)是转化生长因子-β(Transforminggrowthfactor-β,TGF-β)超家族中的一类在结构上高度保守的分泌型蛋白，在发育、血管生成和生殖中发挥重要的功能。BMP2、BMP4、BMP6和BMP10在人类胚胎早期发育过程中参与调控滋养细胞分化，目前BMPs成员中，只有BMP2被报道能够发挥促进滋养细胞侵袭的生物学功能，尽管如此，胎盘中BMP2的主要细胞来源尚不明确。目前已知组蛋白修饰在滋养细胞分化和胎盘发育中具有重要作用，其中组蛋白H327位赖氨酸三甲基化(H3K27me3)与基因沉默相关，增强zeste同源蛋白2(EZH2)具有组蛋白甲基转移酶活性，可催化H3K27me3修饰。已有研究表明，在小鼠胚胎成纤维细胞中，H3K27me3修饰可调控BMP2表达。然而，H3K27me3修饰是否调控人类胎盘BMP2通路及BMP2通路在子痫前期中发挥的具体功能和分子机制尚待深入研究。<br>　　目的<br>　　阐明BMP2在胎盘的细胞来源及其在子痫前期疾病中发挥的具体功能，探究BMP2分子表达的上下游调控机制，借助子痫前期动物模型探索其潜在的治疗作用。<br>　　方法<br>　　收集子痫前期患者和健康产妇剖宫产后胎盘组织，通过RNA-seq和ChIP-seq多组学分析建立子痫前期胎盘的转录谱和H3K27me3修饰图谱;通过ELISA,WesternBlot,RT-qPCR检测血清和胎盘BMP2表达水平，与临床表型指标进行关联分析;通过免疫荧光明确BMP2在胎盘中的细胞表达定位并用流式分选胎盘Hofbauer细胞，利用EZH2抑制剂DZNep处理Hofbauer细胞明确BMP2是否受到H3K27me3修饰调控。<br>　　对BMP2干预后的HTR-8/SVneo细胞(人永生化绒毛外滋养细胞系)进行转录组测序分析，筛选到差异表达基因BMP6;通过Transwell侵袭实验、绒毛外植体及内皮小管形成实验探究BMP6对滋养细胞生物学行为的作用并明确BMP6在BMP2诱导滋养细胞侵袭过程的介导作用。<br>　　通过TGF-β超家族Ⅰ型受体小分子抑制剂DMH-1和SB431542及小干扰RNA处理滋养细胞，明确BMP2调控BMP6表达的信号通路;分析单细胞转录组数据并利用免疫荧光染色明确BMP2及其受体的细胞亚型和空间定位。<br>　　利用可溶性FMS样酪氨酸激酶1(sFlt-1)过表达腺病毒建立子痫前期大鼠模型，在妊娠中期注射重组大鼠BMP2蛋白，通过监测血压和蛋白尿，测量胎鼠和胎盘重量，组织切片HE染色，明确BMP2对子痫前期大鼠模型类子痫前期表型的挽救作用。<br>　　结果<br>　　BMP2在PE胎盘中表达增高，并与临床表型负相关。<br>　　通过7例子痫前期和7例健康产妇剖宫产后胎盘组织的转录组测序分析发现BMPtargets和EZH2targets富集，而且BMP2mRNA水平在PE胎盘表达增高，进一步通过公共转录组数据库和RT-qPCR明确BMP2的mRNA水平在PE胎盘中升高。胎盘BMP2的mRNA表达水平和血压关联分析结果显示呈显著负相关，提示子痫前期胎盘中促滋养细胞侵袭分子BMP2的表达升高可能作为子痫前期发生进展的一种自身代偿机制。<br>　　BMP2定位于胎盘Hofbauer细胞并受H3K27me3修饰调控<br>　　胎盘ChIP测序结果显示在PE胎盘中，基因组的H3K27me3修饰水平低于正常胎盘，WesternBlot结果显示PE胎盘中H3K27me3蛋白水平显著低于正常妊娠胎盘，而PE胎盘中BMP2蛋白水平显著高于正常妊娠胎盘，进一步通过ChIP测序分析发现PE胎盘BMP2基因启动子区域的H3K27me3修饰水平低于正常胎盘，早产和足月产胎盘的Westernblot结果显示BMP2和H3K27me3水平在孕34周后稳定，排除了正常妊娠和PE组由于分娩孕周差异导致的对结果的干扰，上述结果表明H3K27me3修饰参与胎盘BMP2的表达调控。<br>　　胎盘单细胞转录组分析和免疫荧光结果显示BMP2在胎盘定位于胎儿源性的巨噬细胞，即Hofbauer细胞。利用流式分选并在体外培养人原代Hofbauer细胞，进行DZNep处理，RT-qPCR结果显示用DZNep处理后BMP2的mRNA水平上调，上述结果说明H3K27me3修饰调控人胎盘Hofbauer细胞中BMP2的表达。<br>　　BMP2通过上调BMP6促进滋养细胞侵袭<br>　　BMP2体外处理HTR8/SVneo细胞的转录组测序结果显示BMP6显著上调，RT-qPCR进一步验证BMP6呈时间和剂量依赖性升高。同时，ELISA结果显示BMP6在PE血清中水平升高，可能是PE的潜在靶标。<br>　　Transwell、内皮小管形成实验和绒毛外植体外生实验显示，重组BMP6蛋白处理可促进滋养细胞侵袭和内皮特性获得，进一步小干扰敲降BMP6和使用重组BMP2干预，结果表示BMP6介导BMP2的促滋养细胞侵袭和内皮特性获得的生物学行为。使用DMH-1（ACVR1和BMPR1A的抑制剂）和SB431542（ACVR1B和TGFβRI的抑制剂）处理HTR8/SVneo细胞发现只有DMH-1可抑制SAMD1/5/9和SMAD2/3磷酸化以及BMP6的上调，小干扰RNA敲降ACVR1或者BMPR1A,发现仅敲降BMPR1A可抑制BMP6表达上调和SMADs的磷酸化，进一步小干扰RNA敲降SMADs，发现仅敲降SMAD2/3或者SMAD4可抑制BMP2诱导的BMP6表达上调，上述结果表明，BMP2通过BMPR1A-SMAD2/3-SMAD4依赖的信号通路上调BMP6表达。<br>　　BMP2可以挽救sFlt-1子痫前期大鼠模型的类子痫前期表型<br>　　体内注射重组大鼠BMP2蛋白可以挽救子痫前期大鼠模型的高血压、胎儿生长受限、胎盘重量下降和胎盘迷路区与连接区面积比例下降的表型，并未缓解肾脏的损伤,未出现异位骨形成的副作用，说明了BMP2重组蛋白外源性补充可以部分挽救类子痫前期表型，提示BMP2作可为子痫前期的潜在干预靶标。<br>　　结论<br>　　子痫前期患者胎盘中H3K27me3修饰降低，导致Hofbauer细胞中BMP2表达增加，BMP2通过BMPR1A-SMAD2/3-SMAD4信号通路上调滋养细胞中BMP6表达，进而促进滋养细胞侵袭和内皮特性获得以代偿子痫前期的滋养细胞浅浸润，外源性补充重组BMP2蛋白可以挽救子痫前期大鼠模型的类子痫前期表型。本研究丰富了子痫前期的病因机制，为子痫前期的临床干预提供了潜在的分子靶标。