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摘要背景<br>　　子痫前期(preeclampsia，PE)是妊娠期高血压疾病的主要类型，是导致孕产妇发病和死亡的主要原因，其病因和发病机制一直是围产医学研究领域关注的热点。Apelin受体(APLNR，APJ/AR)是根据其与血管紧张素Ⅱ受体的序列同源性而命名的G蛋白偶联受体，目前已发现的内源性配体有两种，一种是1998年从牛胃中提取出来的Apelin多肽，另一种是2013年研究首次发现的APJ内源性配体ELABELA(ELA)多肽。研究发现两种配体是调节成人循环系统、舒张血管、降低血压、维持体液平衡的重要激素。有研究发现敲除ELA基因的妊娠小鼠出现子痫前期症状，蛋白尿和血压水平明显高于野生型妊娠小鼠和ELA缺失但未妊娠的小鼠。对出现子痫前期症状的ELA缺失妊娠小鼠人为补充ELA激素，恢复了胎儿体重，逆转了蛋白尿，为子痫前期的治疗和干预提供了新思路。研究强调ELA主要通过APLNR(APJ/AR)调节PE过程，已有研究报道ELA、APLNR在PE患者胎盘中表达下调，然而目前大多数报道主要集中在配体ELA的功能上，对于APLNR的作用机制研究较少，ELA/APLNR信号轴可能通过哪些下游信号分子影响子痫前期的发生，其作用机制仍未了解。<br>　　近年来，表观遗传等因素被认为与PE的发生机制有关，DNA甲基化是最常见的表观遗传修饰，主要发生在胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)中，以抑制基因转录，越来越多的研究发现DNA甲基化参与调控子痫前期的发展过程。通过MethPrimer网站预测APLNR启动子上DNA甲基化位点，结果发现位于APLNR启动子上游4k-5kb序列之间有两个CpG岛，表明APLNR存在甲基化结合位点。因此深入探索APLNR在子痫前期发生过程中是否受甲基化调节具有重要意义。<br>　　本课题提出以下问题:①在子痫前期体内外模型中，APLNR基因的甲基化水平是否改变？②通过DNA甲基化转移酶能否改变APLNR的甲基化水平从而改变其转录水平？③ELA/APLNR通路是否促进eNOS转录并介导滋养层细胞增殖、迁移及侵袭等功能？我们将针对APLNR甲基化水平改变是否影响APLNR转录水平从而参与子痫前期过程展开研究。<br>　　研究目的<br>　　1体外实验研究缺氧复氧条件下滋养细胞APLNR甲基化及转录水平是否受DNA甲基化转移酶DNMT调节。<br>　　2研究ELA/APLNR通路是否促进eNOS转录并介导缺氧复氧条件下滋养细胞增殖、迁移及侵袭;DNMT1是否通过介导APLNR甲基化水平促进eNOS转录从而影响滋养细胞表型功能。<br>　　3构建小鼠PE模型，体内实验探索DNMT1调节APLNR甲基化水平并介导PE发展进程。<br>　　研究方法<br>　　1研究对象<br>　　1.1培养人源胎盘滋养细胞株HTR8/Svneo细胞<br>　　实验分组:<br>　　1.1.1对照组:正常条件下20％O2浓度培养HTR8/Svneo细胞;<br>　　1.1.2H/R组（缺氧/复氧模型，模拟PE缺血再灌注病理条件）:HTR8/SVneo细胞先缺氧再复氧，即2％O2作用8h,20％O2作用16h，共2个循环，48h后收集细胞进行后续实验。<br>　　1.1.3H/R+shRNA/sh-DNMT1组:转染阴性对照shRNA或sh-DNMT1的HTR8/Svneo细胞再进行缺氧复氧处理。<br>　　1.1.4H/R+ELA组或H/R+ELA+L-NAME（NOS抑制剂）组:HTR8/SVneo细胞在第二轮缺氧处理后，加入含有0.25nMELA和/或2mML-NAME的培养基，再复氧16h。<br>　　1.1.5H/R+sh-DNMT1+shRNA/sh-APLNR组:转染sh-DNMT1和shRNA/sh-APLNR的HTR8/Svneo细胞再进行缺氧复氧处理。<br>　　1.2动物实验<br>　　构建PE小鼠模型，C57BL/6小鼠按雌雄比例2∶1进行笼内交配。第二天早晨有阴栓者或阴道分泌物涂片见精子的雌鼠视为交配成功，以妊娠第0天计算。将12只孕鼠随机分为正常组和PE组。在妊娠第9天(GD9)至妊娠第19天，PE组小鼠皮下注射L-NAME(125mg/kg),对照组注射生理盐水。将24只妊娠小鼠随机分为正常组、PE组、PE+Ad-shRNA组、PE+Ad-shDNMT1组(n=6)。PE+Ad-shRNA/Ad-shDNMT1组，在GD12时向小鼠尾静脉注射腺病毒(0.5×109PFU/mL)。<br>　　2研究方法<br>　　qRT-PCR及WB检测细胞及组织标本中各指标mRNA/蛋白表达水平;MSP检测APLNR基因甲基化水平变化;ChIP-qPCR分别检测DNMT在APLNR启动子处的结合情况。MTT检测0-72h细胞增殖情况;划痕实验检测各组细胞迁移能力;transwell检测各组细胞侵袭能力;ELISA检测细胞上清或小鼠血浆中NO水平。测量怀孕小鼠G1和G19时的收缩压，检测各组怀孕小鼠的胎儿体重、胎盘体重;小鼠胎盘组织切片进行HE染色。<br>　　3统计方法<br>　　采用SPSS20.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示各组之间的差异具有显著性。<br>　　结果<br>　　1体外实验验证APLNR甲基化水平由DNMT1调控<br>　　模拟PE病理条件培养HTR8/Svneo细胞，细胞分为对照组和H/R组。与对照组相比，H/R组APLNR表达下调，APLNR甲基化水平上调。H/R组DNMT1下调，DNMT3a和DNMT3b无明显变化。H/R组DNMT1在APLNR启动子上的结合上调，而DNMT3a和DNMT3b没有变化。在上述实验基础上进一步分组，HTR8/Svneo细胞分为H/R、H/R+shRNA和H/R+sh-DNMT1。与H/R组相比，干扰DNMT1表达后，APLNR启动子甲基化水平降低，而APLNRmRNA和蛋白水平明显上调。上述结果表明，APLNR的甲基化水平主要受DNMT1在APLNR启动子上的结合效率的影响。<br>　　2DNMT1通过介导APLNR甲基化水平影响滋养细胞表型功能<br>　　2.1ELA激活APLNR促进eNOS转录，介导EVTs增殖、迁移和侵袭<br>　　将HTR8/Svneo细胞分为对照组、H/R、H/R+ELA、H/R+ELA+L-NAME,采用ELA激活APLNR,L-NAME抑制eNOS表达。H/R处理显著抑制了细胞的增殖活性，而添加ELA促进了细胞的增殖、迁移和侵袭，L-NAME则逆转了ELA的作用。添加ELA可提高H/R细胞NO水平，上调APLNR和eNOS表达。L-NAME抑制H/R细胞NO和eNOS水平，但不影响APLNR的表达。这些结果表明，激活APLNR可以促进eNOS的转录，从而促进细胞增殖、迁移和侵袭，促进NO的分泌，而eNOS抑制剂干预可以逆转APLNR的作用。<br>　　2.2DNMT1通过介导APLNR甲基化水平促进eNOS转录，影响EVTs增殖、迁移和侵袭<br>　　HTR8/Svneo细胞分为H/R+shRNA、H/R+sh-DNMT1、H/R+sh-DNMT1+shRNA、H/R+sh-DNMT1+sh-APLNR。与H/R+shRNA相比，sh-DNMT1组APLNR启动子甲基化水平明显下调。干扰DNMT1表达后,APLNR和eNOS的mRNA、蛋白水平显著上调，干扰APLNR表达后，逆转了上述结果。干扰DNMT1表达促进了细胞的增殖、迁移和侵袭，而干扰APLNR表达则逆转了这一作用，下调APLNR表达可逆转sh-DNMT1引起的NO水平升高。上述体外实验结果表明，下调DNMT1通过抑制APLNR甲基化水平促进eNOS转录，从而促进EVTs增殖、迁移和侵袭。<br>　　3DNMT1在体内调节APLNR甲基化水平并介导PE过程<br>　　建立PE小鼠模型，干扰DNMT1表达成功后，在GD19采集正常组、PE组、PE+Ad-shRNA组、PE+Ad-shDNMT1组的尿液、血浆和胎盘组织样本。与正常组比较，PE组小鼠血压、尿蛋白水平均上调。转染Ad-shDNMT1后，胎数和胎盘重量没有变化，但可以修正PE引起的胎儿体重减轻的影响。干扰DNMT1可有效缓解PE诱导效应，增加海绵滋养层细胞数量，上调血浆NO水平。其次，PE组DNMT1表达下调，转染Ad-shDNMT1后DNMT1表达持续降低。与对照组相比，干扰DNMT1可上调APLNR和eNOS水平。此外，干扰DNMT1后APLNR启动子甲基化水平降低。该体内实验表明DNMT1通过介导APLNR甲基化水平影响eNOS转录和PE发展过程。<br>　　结论<br>　　1体外实验中，DNMT1在H/R条件下通过提高DNMT1在APLNR启动子处的结合效率促进甲基化，抑制APLNR的表达;干扰DNMT1表达，上调了APLNRmRNA和蛋白水平。<br>　　2体外实验中，干扰DNMT1表达抑制APLNR甲基化水平，促进eNOS转录，促进了滋养细胞增殖、迁移和侵袭。<br>　　3在子痫前期动物模型中，APLNR的表达减少，APLNR甲基化水平上调，DNMT1在APLNR启动子上的结合增加。干扰DNMT1对APLNR的作用，在动物实验中改善了PE的尿蛋白水平，并增加了胎鼠体重。